CRISRP/Cas9是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的基因編輯技術(shù)，利用這項(xiàng)技術(shù)，研究者可以根據(jù)需求對特定染色體位點(diǎn)進(jìn)行高效的改造。然而該技術(shù)也受到了脫靶效應(yīng)的困擾。ChIP-seq是用于在全基因組范圍中研究DNA結(jié)合蛋白、組蛋白修飾和核小體的技術(shù)，常用于表觀遺傳學(xué)方面的研究。在今天向大家介紹的文章中，作者將CIRSPR/Cas9技術(shù)和ChIP-seq技術(shù)相結(jié)合，首次在奶牛中定點(diǎn)插入了結(jié)核病抗性基因，獲得了正確插入該基因的能夠抵抗牛結(jié)核病的奶牛，并且在這些奶牛中沒有檢測到脫靶效應(yīng)。

 

研究背景 
      同源重組（HDR）是一種針對染色體特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯的有效手段，在以往的研究中常會利用鋅指核酸酶或者TALEN技術(shù)來引起DNA雙鏈的斷裂，然后根據(jù)提供的模板序列進(jìn)行同源重組修復(fù)，從而達(dá)到對染色體的定點(diǎn)改造。近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)使基因編輯變得更為簡便，這也使得該技術(shù)被迅速應(yīng)用在科研、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。 
      CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用Cas9蛋白中的兩個核酸酶活性位點(diǎn)分別對DNA的雙鏈進(jìn)行切割，引起DNA雙鏈的斷裂，然而在DNA斷裂處的修復(fù)過程中，除了根據(jù)提供的模板進(jìn)行同源重組修復(fù)之外，還有另外一種修復(fù)機(jī)制也同樣存在，即非同源末端連接（NHEJ）。在這個過程中，會引起DNA斷裂處發(fā)生小片段的插入或缺失（indel），從而造成不可預(yù)知的后果。同時，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)還會引發(fā)脫靶效應(yīng)。這些潛在的弊端會對基因的定點(diǎn)改造，特別是在基因治療以及轉(zhuǎn)基因動物的繁育中帶來一定的安全問題。 
      目前在這方面已經(jīng)開展了一系列工作，希望能夠提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率、位點(diǎn)識別的特異性以及發(fā)掘更多功能上的延展。不過在哺乳動物中進(jìn)行較大功能性基因插入的研究工作還比較有限。

近日，來自中國西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院的張涌教授團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，首先在奶?；蚪M中分析得到了潛在的適用于基因定點(diǎn)編輯的位點(diǎn)，然后結(jié)合ChIP-seq，靶向PCR測序等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，得到了針對這些位點(diǎn)的結(jié)合效率以及潛在的脫靶位點(diǎn)，并對DNA編輯效率進(jìn)行了評價。其中烈冰科技在ChIP-seq的測序?qū)嶒?yàn)及數(shù)據(jù)分析過程中提供了有力的支持，通過基因組層面的分析，得到了靶向位點(diǎn)的相關(guān)重要信息。 
接著張教授團(tuán)隊(duì)通過單個核酸酶失活的Cas9蛋白（Cas9 nickase，Cas9n）結(jié)合選定的編輯位點(diǎn)，造成了DNA單鏈的斷裂，并介導(dǎo)了同源重組修復(fù)，在奶?；蚪M中定點(diǎn)插入了一個結(jié)核病相關(guān)的抗性基因，得到了具有抵抗牛結(jié)核病能力的奶牛，同時針對ChIP-seq分析得到的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行檢測后沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生。 
該研究結(jié)果以”Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced off-target effects”為題發(fā)表于著名學(xué)術(shù)期刊Genome Biology。

---

研究思路 
     首先我們來理清這項(xiàng)研究思路，如下圖所示。

---

研究結(jié)果 
      1、作者選取25號染色體上FSCN1以及ACTB兩個管家基因的基因間區(qū)作為潛在的基因插入位點(diǎn)，從而理論上可以有效避免因染色質(zhì)失活而引起的基因表達(dá)沉默。通過在線分析工具ZiFiT，找到了80個靶位點(diǎn)，并根據(jù)off-target預(yù)測工具Cas-OFFinder以及錯配堿基的位置最終選取了14個靶位點(diǎn)，設(shè)計sgRNA后用于后續(xù)檢測。在確定了合適濃度后，作者在牛胎兒成纖維細(xì)胞中利用錯配內(nèi)切酶檢測法得到了針對這14個位點(diǎn)的切割效率。

2、接下來作者想進(jìn)一步分析這些位點(diǎn)結(jié)合的特異性以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的程度。作者利用dCas9，選取2、20、22、45號4個位點(diǎn)，通過ChIP-seq的方式進(jìn)行檢測。分析結(jié)果顯示在每一個sgRNA對應(yīng)的位點(diǎn)上都發(fā)現(xiàn)了較強(qiáng)的peak，同時也得到了該sgRNA/dCas9在其他位點(diǎn)上的結(jié)合，這些區(qū)域中潛在的位點(diǎn)都有可能是在實(shí)際基因編輯過程中的脫靶位點(diǎn)。通過計算分析得到每個結(jié)合區(qū)域潛在的20bp識別序列后，對該序列堿基組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)PAM序列附近的堿基較PAM序列遠(yuǎn)端的堿基具有更高的保守性。

3、根據(jù)ChIP-seq的結(jié)果，作者計算了peak的富集度，并且列舉了每一個sgRNA對應(yīng)的15個富集度最高的off-target位點(diǎn)以及堿基匹配信息。

4、隨后，作者通過WT Cas9和Cas9n蛋白配合4種sgRNA進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并且利用PCR擴(kuò)增了每個sgRNA經(jīng)ChIP-seq分析得到的on-target區(qū)域和15個off-target區(qū)域，進(jìn)行高通量測序，去分析DNA的切割效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在WT Cas9蛋白的結(jié)果中，on-target位點(diǎn)發(fā)生indel的概率非常高，同時也有數(shù)個off-target位點(diǎn)indel水平也要顯著高于對照組。而單個Cas9n的indel概率和對照組基本一致，低于WT Cas9，暗示單個Cas9n介導(dǎo)的單鏈斷裂可以從一定程度上避免NHEJ修復(fù)機(jī)制的發(fā)生。

5、接著，作者希望進(jìn)一步去評價Cas9n介導(dǎo)的同源重組效率。作者選取了20、45號位點(diǎn)以及2+19、16+34號位點(diǎn)組合共4組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并以此設(shè)計了兩個用于同源重組修復(fù)的質(zhì)粒。將WT Cas9、Cas9n連同sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測了DNA的重組效率。結(jié)果顯示與WT Cas9相比，所有單個Cas9n介導(dǎo)的同源重組效率都相對較低。而在20和45號位點(diǎn)，單個Cas9n與配對Cas9n的效率相似，這暗示著單個Cas9n介導(dǎo)的單鏈斷裂也可以引起同源重組的發(fā)生。

6、在完成了前期的可行性實(shí)驗(yàn)后，作者選取了一個牛結(jié)核病相關(guān)的抗性基因NRAMP1，并試圖將該基因插入奶牛基因組的特定位點(diǎn)中。作者還是利用WT Cas9、Cas9n并結(jié)合4種位點(diǎn)組合方式（20、45、2+19以及16+34），將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入牛胎兒成纖維細(xì)胞中。經(jīng)嘌呤霉素篩選陽性克隆后，采用PCR以及southern blot的方式來鑒定同源重組是否正確發(fā)生。

7、接著，作者對篩選到的細(xì)胞進(jìn)行了核型分析、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，生長速率分析等多種指標(biāo)評價，在45號位點(diǎn)得到了113個雜合的克?。ǚ謩e為WT Cas9 50個和Cas9n 63個），這些細(xì)胞可用于體細(xì)胞核移植。作者隨機(jī)各挑選了4個克隆進(jìn)行體細(xì)胞核移植，分別得到了2385和2434個重組胚胎，其中又分別有525和753個胚胎成功發(fā)育到了囊胚期，作者將其接入了173只以及248只母牛的輸卵管中。最終共有20只（Cas9n組16只）小牛出生并且有11只（Cas9n組9只）存活了超過3個月。作者再次通過PCR以及southern bolt鑒定了11只小牛的重組情況，并確認(rèn)NRAMP1準(zhǔn)確插入了45號位點(diǎn)。

8、與此同時，作者對15個ChIP-seq分析得到的off-target位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，結(jié)果在WT Cas9組中發(fā)現(xiàn)了3個位點(diǎn)存在indel，而在Cas9n組的9只牛中沒有發(fā)現(xiàn)任何的indel事件。

9、最后，作者檢測了45號插入位點(diǎn)鄰近基因的表達(dá)，并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異。同時也檢測了NRAMP1在體內(nèi)的表達(dá)分布情況。然后作者通過體外以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了轉(zhuǎn)基因奶牛確實(shí)能夠增強(qiáng)對牛分枝桿菌的抵抗能力。

通過上述實(shí)驗(yàn)及分析，作者首次將單個Cas9n技術(shù)運(yùn)用到家畜中，并成功獲得了抗牛結(jié)核病的奶牛。后續(xù)檢測中沒有在這些奶牛 中發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生，使得這個位點(diǎn)成為了在牛基因組中一個有用的位點(diǎn)，利用基因編輯技術(shù)靶向這個位點(diǎn)可以插入其他有益于家畜的新基因。同時也暗示著這項(xiàng)技術(shù)可以作為一種潛在的更安全的方法來進(jìn)行基因編輯，為轉(zhuǎn)基因家畜的培育提供了新的手段。