研究背景

為了研究畢氏酵母發酵過程中基因的變化，吉林大學梁重陽團隊以畢氏酵母對甲醇適應性發酵rHSA(人重組白蛋白)過程為模型，研究了畢氏酵母發酵過程中轉錄組學與關鍵發酵階段的關系。該研究最近以“Transcriptional Regulation of AerobicMetabolism in Pichia pastoris Fermentation”為題發表于著名學術期刊PLOS ONE，烈冰生信團隊在測序和生信分析方面給予了有力的支持。
酵母發酵過程主要有5個時間節點，1-(12h)-對數生長期，2-(30h)-甲醇取代甘油作為能源起始點，3-(48h)-酵母適應甲醇生長階段，4-(90h)-產物積累頂峰，5-(108h)-發酵結束和產物降解。酵母發酵過程有兩個關鍵階段，限制碳源替代和甲醇誘導蛋白表達。限制碳源替代就是把酵母發酵的能源從甘油轉變為甲醇，酵母需要經過一段時間的適應過程才能繼續生長；甲醇誘導蛋白表達是酵母適應了甲醇以后大批量生產蛋白及末期細胞凋亡和產物降解的過程。為了探究這兩個階段中基因發生的變化，分別取這兩個階段中三個重要的節點做了趨勢分析（1-2-3即限制碳源替代和3-4-5即甲醇誘導蛋白表達）。用GO-Term進行聚類，最后通過co-exp-net鎖定一個與氧化還原代謝相關的基因PAS_chr2-1_0582，并通過同源重組的方法敲除目的基因，發現醇類消耗是對照組的1/5，過氧化物酶體生成也是減少的。

分析思路

實驗取了5個不同發酵節點的畢氏酵母，提取RNA，進行測序，分別對1-2-3和3-4-5兩個階段進行轉錄組學研究，通過生物信息分析，鎖定目的基因，并通過基因敲除實驗驗證此基因在發酵過程中的核心地位。

１. 首先建立了甲醇誘導畢氏酵母發酵表達rHSA的經典發酵模型。

2. 分別對1-2-3和3-4-5兩種結果進行了趨勢分析，并對差異基因進行GO功能富集。發現1-2-3階段趨勢6和趨勢7（上升的趨勢）主要與囊孢子形成和跨膜轉運等相關，而趨勢0和趨勢1（下降的趨勢）主要與轉錄調節有關。這與酵母發酵生長曲線使一致的。而3-4-5階段趨勢5（先升后降）和趨勢3（先平后降）主要與蛋白轉運相關。

3. 分別對1-2-3和3-4-5兩個階段的相關基因做了共表達網絡分析，找出核心基因。
1）對1-2-3階段 GO分析中192個相關的基因做動態共表達網絡分析，找出K-core值大于或等于10的29個核心基因，發現這些基因都集中分布在單一的子網絡，均為下降的趨勢，而這些基因均與細胞生長有關，這與發酵過程中細胞生長曲線是一致的。

  2）對3-4-5 階段GO分析中231個相關的基因做動態共表達網絡分析，找出此階段核心基因，大多數核心差異基因與蛋白轉運和膜轉運相關。

4. 針對以上兩個階段的核心基因分別做了Go-Gene-Tree，發現兩個階段都是與氧化還原過程相關的。
1）在1-2-3階段Go-Gene-Tree。可以看到差異基因主要與需氧呼吸和三羧酸循環有關。

  2）在3-4-5階段Go-Gene-Tree，發現核心基因都是與氧化還原過程的步驟是相關的，比如有氧呼吸、電子傳遞鏈、NADPH生成等過程。基因主要與需氧呼吸和三羧酸循環有關。

5. 選取了與氧化還原過程相關的核心基因PAS_chr2-1_0582運用同源重組進行敲除驗證發現此基因敲除可抑制醇類的消耗，證明了此基因確實與氧化還原過程相關。

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