腎細胞癌（RCC）是世界上最常見的十大惡性腫瘤之一，主要表現為透明細胞性腎細胞癌（ccRCC）。ccRCC是最常見的腎細胞癌病理亞型，約占腎細胞癌的60%～85%，侵襲性強，轉移率和死亡率高。代謝失調是ccRCC的一個關鍵特征，迄今為止，大多數臨床代謝組學研究只關注代謝組學分析，單細胞和空間組學技術的發展有助于以更高的分辨率探索ccRCC中的腫瘤微環境（TME）圖譜。

      本期，小編就來介紹一下烈冰生物合作伙伴華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院諶科教授、陶振教授、管維教授和海軍軍醫大學附屬長征醫院任善成教授發表在《Nature Genetics》的文章，題目為“Multi-omic profiling of clear cell renal cell carcinoma identifies metabolic reprogramming associated with disease progression”。這篇文章對同濟醫院100例ccRCC患者（TJ-RCC）隊列使用多組學聯合分析，發現了一個獨特的亞型：DCCD-ccRCC。并通過單細胞和空間軌跡分析，證明了DCCD是ccRCC進展的一種常見模式，揭示了ccRCC的進展機制。烈冰生物提供了單細胞核測序實驗的相關服務。

發表日期：2024年2月

發表期刊：Nature Genetics

影響因子：IF=30.8

實驗設計

• 單細胞捕獲平臺：10X Genomics

• 主要技術手段：

1. 全外顯子測序（WES）、全轉錄組測序（WTS）、蛋白質組學、非靶向代謝組學：100份未經治療的ccRCC樣本、50份配對的正常鄰近組織（NATs）樣本

2. 單細胞核測序（SnRNA-seq）：不同亞型的ccRCC樣本（n=10）

3. 單細胞ATAC-seq（SnATAC-seq）：不同亞型的ccRCC樣本（n=10）

4. 空間轉錄組測序：不同亞型的腫瘤切片（n=12）和配對的NAT對照組（n=2）

主要研究結果解析

01 多組學描述同濟醫院RCC（TJ-RCC）隊列的分子特征

      研究團隊使用全外顯子測序（WES）、全轉錄組測序（WTS）、蛋白質組學和非靶向代謝組學（包括LC-MS和GC-MS）等技術，對100份未經治療的ccRCC樣本和50份配對的正常鄰近組織（NATs）進行了分析。基因組的分析結果表明本研究中最頻繁的突變基因與之前的研究一致；轉錄組和蛋白組的數據表明，腫瘤和正常臨近組織（NATs）之間有顯著的區別。代謝組學分析結果與轉錄組和蛋白質組分析的結果一致，并發現ccRCC的一個標志，即脂滴（LDs）的積累可能是由β-氧化活性降低引起的。

02 ccRCC可分為四種免疫亞型

      研究團隊從一個公開的scRNA-seq數據集生成了一個ccRCC的特征矩陣，并確定了25種不同的細胞類型。該矩陣將腫瘤樣本分為四種免疫亞型（IM1- IM4）。其中，IM1腫瘤的特征是內皮細胞和基質細胞特征豐富，免疫細胞特征缺乏；IM2腫瘤也具有豐富的內皮信號，而免疫細胞和基質細胞特征缺乏。在四個亞型中，IM3腫瘤的內皮細胞和基質細胞特征水平最低，但T細胞和腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）評分增加，IM4腫瘤的基質細胞和TAM評分最高，T細胞評分居中。

03 單細胞測序表征免疫亞型中細胞組成的異質性

      為了進一步研究四種IM亞型的免疫細胞組成異質性，對10個樣本（4個IM1、2個IM2、2個IM3和2個IM4）進行了單細胞核轉錄組測序（snRNA-seq），另外10個樣本（1個IM1、3個IM2、4個IM3和2個IM4）進行了單細胞ATAC測序（包括snRNA-seq 和單核ATAC測序snATAC-seq）。經過質控，最終97,978個單核細胞分為5種主要細胞類型和41個亞群，并發現四種免疫亞型中的免疫細胞組成有較大區別。

      在IM1和IM2亞型中，單核細胞、LILRB5⁺巨噬細胞（M?03-LILRB5）、終末分化的效應記憶或效應細胞（TEMRA）和活化的NK（aNK）細胞占主導地位。在IM3亞型中，CD8⁺T細胞浸潤增加。并且IM3和IM4腫瘤的TAMs存在顯著差異。在IM3腫瘤中富集了GPNMB⁺巨噬細胞（M?04-GPNMB）、C3⁺巨噬細胞（M?06-C3）和GBP1⁺巨噬細胞（M?07-GBP1），而IM4腫瘤中IGF1⁺巨噬細胞更為豐富。隨后的免疫熒光染色驗證了IGF1⁺巨噬細胞（F13A1⁺）主要定位于成纖維細胞（PDGFRA⁺）富集區域，這支持IGF1⁺巨噬細胞促進IM4腫瘤中成纖維細胞的積累。

04 空間組學揭示TME中的免疫和代謝異質性

      聯合分析顯示，在轉錄組和蛋白質組水平上，IM3樣本中的胞苷、嘧啶和其他核苷代謝相關途徑均增強；隨后，研究團隊基于TCGA KIRC公共數據集，對Teff細胞的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）評分與嘧啶代謝的相關性分析表明，嘧啶/胞苷代謝活性增加與CD8⁺ T細胞浸潤增加和不良預后相關，與在TJ-RCC隊列中的發現相一致。此外，在代謝組數據中觀察到IM3樣本中嘧啶衍生物的增加。然而，盡管IM3是一個CD8⁺ T細胞浸潤的亞組，但IM3腫瘤的預后仍優于IM4腫瘤，這些結果提示CD8⁺ T細胞浸潤可能限制ccRCC的腫瘤進展。

      為了證實上述結果，研究團隊對12個腫瘤切片（4 IM1、4 IM2、3 IM3和1 IM4）和2個配對的NAT對照組進行了空間轉錄組學（ST）和空間代謝組學分析。在屬于IM3組的CD8⁺ T細胞浸潤樣本（R29_T）中檢測到高鳥嘌呤和次黃嘌呤信號，相反，在另一個具有局部淋巴細胞浸潤的IM3樣本中，僅在非TIL浸潤區域檢測到微弱的鳥嘌呤和次黃嘌呤信號。這些結果表明了ccRCC的瘤內異質性（ITH），以及嘧啶衍生物與TILs之間的潛在相關性。這一假設在另一個局部CD8⁺ T細胞浸潤的樣本中得到了進一步的證實。

05 DCCD表現出獨特的代謝特征，預后較差

      由于脂肪酸和氨基酸代謝通路在IM4亞型中下調，同時這些通路在ccRCC腫瘤中也下調。為了系統地研究這些差異，研究團隊鑒定了IM4和其他腫瘤亞型之間的差異表達基因（DEGs），通過聚類分析，共將853個DEGs聚為4個基因modules。在IM4中，module 1和module 2中的基因表達水平高于其他IM，但module 1的基因在NATs中的表達水平最高。對NATs的snRNA-seq數據分析顯示，module 1的基因主要在腎小管細胞中表達，module 2的基因主要在集合管中表達，module 3的基因在正常近端小管中顯著表達，在非IM4腫瘤中下調，但在IM4腫瘤中進一步降低，并且這些基因在脂肪酸、氨基酸和碳水化合物的代謝中富集。ccRCC致癌基因，HIF2A也包含在這個module中，這些基因導致腫瘤細胞中脂滴（LDs）的積累。由于這些特征在IM4腫瘤中大部分被抑制，與module 4相關的特征可能對ccRCC有雙重作用。

      通過對20個隨機選擇的TJ-RCC隊列樣本進行油紅O（ORO）染色驗證，發現在非IM4樣本中表現出“透明細胞”表型的脂滴（LDs）積累，但在IM4樣本中幾乎沒有觀察到LDs，與轉錄組特征一致。代謝組學分析也證實了IM4腫瘤中的代謝重編程。綜上所述，IM4腫瘤的特征包括營養攝取增加、活性氧（ROS）和脂滴（LDs）水平降低、低代謝活性和較高的增殖率。由于ccRCC的特征是在癌細胞中LD的積累，研究團隊將這一過程命名為ccRCC的去透明細胞分化（DCCD）。此外，由于IM4腫瘤已經完成了這一轉化過程，將其稱之為DCCD-ccRCC。此外，研究團隊發現原發腫瘤被分層為DCCD腫瘤的患者總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）明顯較差，表明局限性DCCD-ccRCC患者應被識別并給予進一步治療。

06 從非DCCD到DCCD的轉變

      對snRNA-seq數據的分析顯示，與在bulk RNA-seq數據中觀察到的IM2和IM4評分之間存在相同的負相關關系。因此，根據DCCD評分將單個癌細胞分為IM2-like或IM4-like表型，表明DCCD過程反映了腫瘤內IM4-like癌細胞的積累。由于DCCD-ccRCC通常比IM1-IM3腫瘤包含更多的臂水平體細胞拷貝數變異（SCNAs），因此作者接下來想探究SCNA是否驅動了DCCD過程。

      在12個ccRCC樣本的切片中，有兩個樣本發現了部分DCCD，其中，Y7_T樣本在bulk RNA-seq和snRNA-seq數據中都顯示出IM2的特征，在Visium切片中顯示出一個亞克隆的DCCD轉移，反映了DCCD誘導的ITH。非DCCD區域表現出經典的“透明細胞”表型，與前面ORO染色觀察到的表型一致。綜上結果表明SCNA事件與DCCD之間沒有絕對的相關性。空間代謝組分析顯示，無論是否存在亞克隆SCNA，DCCD區域的脂肪酸（尤其是長鏈脂肪酸）都較少，從而導致這些區域的LD積累減少。

07 單細胞核測序建立了DCCD的軌跡

      為了更深入地了解向DCCD的轉化過程，研究團隊使用snRNA-seq數據進行軌跡分析，IM4-like單細胞的中心位于軌跡的末端，結果顯示，在整個擬時序時間內，IM4評分增加，IM2評分下降。隨后，通過差異分析，83個差異表達的轉錄因子被分為兩個cluster。HIF1A是RCC的傳統腫瘤抑制因子，在向DCCD分化的后期階段顯著升高。兩個樣本的空間軌跡與snRNA-seq數據的結果一致。使用Monocle 2進行軌跡分析，參與DCCD的關鍵轉錄因子的連續變化在bulk RNA-seq和單核測序數據中高度一致。

      對snATAC-seq數據進行的ChromVAR偏差分析，揭示了DCCD和非DCCD群體中差異最大的激活轉錄因子，AP-1轉錄因子亞基排在首位，其次是BACH1、BACH2和肝細胞核因子家族成員。最后，基于scMEGA分析，作者為DCCD和非DCCD癌細胞構建了不同的基因調控網絡。綜上所述，這些數據為深入了解參與ccRCC進展的轉錄因子調控網絡提供了新的見解。

全 文 總 結

      本研究中，研究團隊首次使用多組學數據聯合分析，揭示了透明細胞性腎細胞癌（ccRCC）中存在四種代謝亞型，并確定了一個具有獨特代謝特征的亞型-去透明細胞分化（DCCD）-ccRCC，其特征包括營養攝取增加、活性氧（ROS）和脂滴（LDs）水平降低、低代謝活性和較高的增殖率。此外，通過單細胞和空間軌跡分析技術，研究團隊還深入研究了ccRCC與疾病進展相關的代謝重編程，并發現ccRCC中的DCCD與不良預后相關，為ccRCC患者的精準治療和預后評估提供了新的見解。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41588-024-01662-5

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撰稿/排版：烈冰市場部