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久別重逢，伴手禮怎么能少？

快來看看烈小冰家新鮮出爐的重磅單細胞研究

胰腺癌，是公認的最致命的惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為9%，是名副其實的“癌王”。由于胰腺癌的高基質密度對T細胞浸潤產生了物理屏障，因此現階段的免疫檢查點抑制劑和嵌合抗原受體T細胞療效甚微。因此，針對固有免疫系統的治療干預可能為目前PDAC免疫療法的替代方案。

既然T細胞無法打入“敵人”內部，擅長“腫瘤諜戰”的專家們決定采取迂回戰術，嘗試從腫瘤內部尋找突破口，瓦解“敵人”的組織。而腫瘤內部微環境中存在的中性粒細胞有可能是可被“策反”的對象，腫瘤相關中性粒細胞（TANs）作為其中的“關鍵人物”，參與促進腫瘤細胞增殖，血管生成，組織重塑，免疫抑制和轉移等多項工作，TANs的浸潤也被認為是影響腫瘤的最不利的預后因素之一。但也有證據表明中性粒細胞也表現出對腫瘤細胞的直接細胞毒性或抗體依賴性細胞毒性以對抗腫瘤進展，因此是否能夠對其“策反”成功尚不清楚，需要對其進行進一步“考察”。

烈冰生物合作伙伴——上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院沈柏用教授團隊針對上述問題開展了系列研究，于近期在GUT(IF=23.06）上發表了題為Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment的研究論文。王俐文博士后為本研究的第一作者，沈柏用教授、陳賽娟教授、蔣玲曦教授為通訊作者，該研究提供了胰腺導管腺癌（PDAC）腫瘤微環境中性粒細胞的綜合圖譜。發現了驅動中性粒細胞朝向促腫瘤亞型的分子機制，該研究成果將有助于開發針對PDAC患者的新型免疫療法，為“策反”中性粒細胞提供新的思路。

發表日期：2022年6月

發表期刊：Gut

影響因子：23.06

烈冰生物參與了本研究中的單細胞測序和數據分析工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和數據分析過程吧~

單細胞測序實驗設計

5名PDAC患者的外周血和PDAC組織、2名健康人（HC）的外周血、2名胰腺炎患者（CP）外周血樣本，分離血液CD66b+中性粒細胞（PMN）和胰腺癌組織 CD45+免疫細胞

單細胞捕獲平臺：BD Rhapsody

單細胞實驗分組：HC-PMN（健康組）x2；CP-PMN（慢性胰腺炎組）x2；PDAC-PMN細胞x5； PDAC免疫細胞x5。

主要技術手段：單細胞測序，空間轉錄組測序，轉錄組測序，蛋白組、代謝組質譜分析，免疫熒光，免疫組化,pcr（qpcr）分析

單細胞分析工具應用：細胞聚類分析，subCluster分析，差異基因表達分析，GO/Pathway分析，擬時序分析，SCENIC分析，cellphone分析等。

研究成果解析

01中性粒細胞的異質性

基于前期隊列研究發現，TANs在PDAC中大量浸潤，且與PDAC患者預后不良相關。利用單細胞測序，研究者共檢測到33891個外周血中性粒細胞和17932個胰腺癌免疫細胞的轉錄組，進一步劃分8種細胞類型，其中中性粒細胞存在兩個細胞群體：Neutrophils 1存在于外周血樣本，Neutrophils 2僅存在于腫瘤組織中。CellphoneDB分析發現，相較于其他的免疫細胞，巨噬細胞與TANs間存在大量的配受體關系對，如CCL13-CCR1,CCL3-CCR1等，表明腫瘤微環境中兩種細胞間的緊密相互作用，這也與免疫熒光染色中TANs和巨噬細胞間的物理距離接近的結果相互印證。

02 TANs異質性分析

為了進一步研究中性粒細胞的異質性，烈冰為研究者提供了subCluster分析，對PDAC患者的中性粒細胞細分，獲得了6個PMN亞群和6個TAN亞群，PMNs表現出相似的表達特征，而TANs存在異質性：TAN-1亞群高表達血管生成因子VEGFA、促轉移因子PLAU、LGALS3等，表現為促癌的特征；TAN-2與炎癥相關（表達NLRP3、CD69和IL1RN等基因）；TAN-3的基因表達特征和PMNs類似且高表達與中性粒細胞跨內皮遷移相關的基因（VNN2和SELL），說明TAN-3可能是遷移到腫瘤微環境中的過渡態細胞；而TAN-4特征性地高表達干擾素刺激基因。

03 TAN-1與PDAC患者不良預后相關

鑒于TAN-3的過渡態特征，研究者應用monocle2算法進一步構建了中性粒細胞狀態軌跡的偽時間圖，以PMN為分化的起點，逐漸轉化為TAN-3過渡態，隨后經過TAN-0和TAN-4的狀態，最后達到終末分化狀態TAN-2和TAN-1。研究者找到了1757個隨擬時軸顯著變化的基因并可歸類為3種表達模式，其中第3組基因在腫瘤微環境晚期被激活，并在缺氧、糖酵解、內質網（ER）應激、IL-1和TNF信號通路等過程富集。進一步，研究者利用ER應激誘導劑（毒胡蘿卜素 THG)、促炎細胞因子IL-1β和TNFα以及缺氧的方式，體外刺激了中性粒細胞樣分化的HL-60（dHL-60）細胞，發現內質網應激和缺氧是誘導中性粒細胞向TAN-1表型分化的關鍵因子。

此外，免疫熒光和免疫組化染色證實在PDAC微環境中存在上述4個亞群。有趣的是，VEGFA+ TANs（TAN-1）通常位于癌細胞附近，使其能夠發揮促腫瘤功能。結合多個臨床數據的進一步分析顯示，VEGFA+ TANs和PDAC患者的不良預后顯著相關。

04 糖酵解顯著增強TAN-1的促腫瘤能力

考慮到代謝狀態與免疫細胞的表型、功能息息相關，研究人員進一步分析中性粒細胞的代謝特征，并發現與其他中性粒細胞亞群相比，糖酵解和缺氧在TAN-1亞群中顯著上調；流式細胞分選的LGALS3⁺ TAN（TAN-1）細胞中，葡萄糖轉運蛋白GLUT1和糖酵解酶HK2、PFKFB3和LDHA的表達上調。為了進一步探索TANs代謝特征的空間分布規律，結合空間轉錄組測序技術，研究者發現相比于間質區，腫瘤和癌旁區域的中性粒細胞糖酵解活性顯著上調，此外轉錄組測序、蛋白組和代謝組的多重分析均證實了相較于外周血PMN，TAN中糖酵解途徑的顯著富集。

那么糖酵解途徑和TANs的促腫瘤功能有什么關聯呢？基于LDHA是糖酵解途徑的關鍵酶，也是TAN-1的關鍵標志基因，團隊通過體外實驗分析了過表達LDHA的dHL-60細胞的功能特征，結果顯示過表達LDHA可使dHL60細胞促進腫瘤細胞生長、抑制T細胞免疫應答。

05 BHLHE40驅動中性粒細胞向促腫瘤表型發展

進一步，研究團隊通過SCENIC軟件分析驅動TANs異質性的上游轉錄因子，發現轉錄因子BHLHE40在TAN-1中顯著表達，調控VEGFA、LGALS3、LDHA和BHLHE40等基因，促進中性粒細胞在腫瘤微環境中向促腫瘤的TAN-1表型分化。BHLHE40過表達和敲除后，受其調節的上述基因的表達量也呈現相應的上調或下調，說明BHLHE40是中性粒細胞向TAN-1表型極化的關鍵調節因子，染色質免疫沉淀實驗也證實了BHLHE40對促腫瘤基因的直接轉錄調節作用。

此外，過表達BHLHE40的dHL-60細胞和PDAC癌細胞共培養后，癌細胞的增殖和遷移能力顯著增強。免疫學實驗顯示，BHLHE40過表達抑制了CD8⁺ T細胞產生促炎細胞因子及淋巴細胞的增殖能力， BHLHE40⁺中性粒細胞的高浸潤也與PDAC不良預后相關，說明BHLHE40是驅動中性粒細胞向促腫瘤和免疫抑制亞型分化的關鍵調控因子。

總的來說，研究者利用單細胞測序、空間轉錄組測序、免疫熒光、免疫組化、代謝組、蛋白組、轉錄組分析等多種技術手段，揭示了胰腺導管腺癌中中性粒細胞的作用。鑒定出了一個中性粒細胞的促腫瘤亞群—TAN-1，揭示了TAN中高糖酵解活性與促腫瘤功能之間的關聯，并證明了缺氧和ER應激誘導的BHLHE40激活可驅動TAN促腫瘤表型。

原文鏈接：doi:10.1136/gutjnl-2021-326070