分析思路：

檢測樣本信息：

PBMC，腦組織，腦脊液

檢測平臺：

質譜流式細胞技術，免疫組織化學，Plate-seq，Drop-seq（10X Genomics）

研究結果：

1. AD患者外周血CD8⁺ T_EMRA細胞增多且與認知能力呈負相關

研究者通過多個隊列分析來評估AD的適應性免疫（圖1a），使用質譜流式細胞技術研究了AD患者和前驅輕度認知障礙（MCI）患者的外周血單個核細胞（PBMC）。然后使用聚類計算方法(spanning-tree progression analysis of density-normalized events，SPADE)進行聚類分析，發現患有MCI或AD的患者存在細胞數顯著增多的CD8⁺群體（圖1b），即cluster 63。該細胞群體的標志物與CD3⁺CD8⁺CD27^- T效應記憶CD45RA⁺（T_EMRA）細胞標志物相一致（圖1d），是一種能夠分泌促炎性細胞因子和細胞毒性分子的具有效應性功能的細胞群體。

為了進一步研究CD8⁺ T細胞在MCI和AD中的作用，研究者在Cohort 2（圖1a）中評估了認知與記憶T細胞種群之間的關系。揭示了在MCI和AD中，CD8⁺ TEMRA細胞與認知能力呈負相關（圖1e）。使用PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)刺激PBMC后，來自MCI或AD患者的CD8⁺ T細胞的IFN-γ水平明顯高于對照CD8⁺ T細胞（圖1f），即MCI或AD患者的外周CD8⁺ T細胞相較于正常人存在一定的功能差異。然后對CD8⁺ TEMRA細胞進行drop-seq單細胞測序且通過差異表達和通路分析發現，MCI和AD患者中CD8⁺TEMRA細胞的氨基酸代謝顯著減少，TCR和細胞因子信號傳導增加（圖1g，h）。

以上結果表明，與對照組相比，MCI和AD患者的外周CD8⁺ TEMRA細胞具有更大的抗原刺激性。

圖1 MCI/AD患者中發現的TEMRA細胞受到抗原刺激性更大

2. CD8⁺ T細胞進入AD患者的大腦

接下來研究者為了確定AD患者的大腦中是否存在CD8⁺ T細胞，對Cohort 3（圖1a）中正常人和AD患者的大腦進行CD8和Aβ免疫組化實驗，以及CD8⁺ T細胞與大腦血管接近程度的分析。發現在三個AD大腦海馬區，伴有腦淀粉樣血管病變的血管周隙中存在大量血管外CD8⁺ T細胞（圖2a），受AD影響的海馬中CD3⁺CD8⁺ T細胞明顯多于對照海馬（圖2b），且CD8⁺ T細胞與微管相關蛋白2 (MAP2)⁺神經元具有一定的相關性（圖2c）。最后研究者從AD患者的大腦海馬附近的軟腦膜中也檢測到了CD3⁺CD8⁺ T細胞（圖2d）。

以上研究結果表明，在AD患者的大腦中檢測到了CD8⁺ T細胞的存在。

圖2 AD患者大腦中檢測到CD8⁺ T細胞

3. AD患者腦脊液中CD8⁺ TEMRA細胞的克隆擴增

CD8⁺ T細胞在腦軟腦膜的定位促使研究者想要繼續探索抗原特異性細胞是否也在CSF中存在。研究者發現健康老年受試者的CSF中的免疫細胞主要包含T細胞，以及少量的先天免疫細胞和微量的B細胞，其中CD8⁺ T細胞群幾乎完全由效應記憶性T細胞（T effector memory，T_EM）細胞組成，TEMRA細胞約占該T_EM群的20％。

在接下來的研究中，研究者使用plate-seq和drop-seq兩種測序方法進行T細胞的克隆擴增評估，患者數據均來源于Cohort 4（圖1a）。發現在CSF的T細胞中主要是CD8⁺T細胞發生克隆擴增，其中一位AD患者的存在大量擴增的克隆，占CD8⁺ T細胞的44％（圖3b）。隨后Marker基因鑒定發現該克隆為CD8⁺ CD45RA ⁺ CD27^- TEMRA細胞（圖3c）。這項發現首次提出了受年齡相關神經退行性病變影響的大腦腦脊液中存在克隆擴增的CD8⁺ T細胞。

研究者使用drop-seq對CSF細胞進行細胞分群時同樣發現大多數CSF細胞是T細胞（圖3d,e）。然后對這些細胞進行了單細胞TCR測序（scTCR-seq），發現來自MCI或AD患者的CSF細胞中有許多高度擴增的CD8⁺克隆，而對照組則相反（圖3f,g,h）。通過差異表達分析發現MCI和AD中高度擴增的克隆（即具有五個以上相同TCRαβ序列的T細胞）表現出細胞毒性效應基因的表達增加（圖3i）。通過占比分析發現49.13％的克隆擴增細胞是CD8⁺ TEMRA細胞（圖3j），且MCI和AD中的這類細胞同樣表現為細胞毒性效應基因表達的增加。尤其在MCI和AD病患中高表達影響認知的衰老因子人類白細胞抗原C（HLA-C）和β-2-微球蛋白（B2M）以及其他與AD相關的基因。（圖3k）。研究者還發現CD8⁺ T細胞中GZMA基因的表達（圖3l）以及AD患者海馬中GZMA⁺CD8⁺細胞具有更高的百分比（圖3m）。

以上結果揭示了AD患者的CSF中CD8⁺ TEMRA克隆細胞的促炎和細胞毒性功能。

圖3 AD患者的CSF中CD8⁺ TEMRA細胞發生克隆擴增且具有促炎功能

4.AD患者腦脊液中克隆擴增TCRs的抗原鑒定

接下來，研究者希望確定是何種抗原引起了CD8⁺ TEMRA細胞的克隆擴增。通過構建TCRαβ序列的未加權網絡發現一例MCI和一例AD患者間具有一個共享的克隆，而另一例AD患者共享了其中的TCRβ序列，這條TCRβ序列（CASSLGQAYEQYF）對一種皰疹病毒EBV的EBNA3A抗原（Herpesviridae Epstein–Barr nuclear antigen 3）具有特異性（圖4b），并在該克隆中發現細胞毒性效應基因表達增加（圖4c）。隨后研究者使用GLIPH算法對未知的TCR序列進行特異性抗原的確定。發現AD患者共享的TCRβ鏈（CASSLAGGYNEQFF）與第三位AD患者的TCRβ鏈（CASSLGTGNNEQFF）具有同源性（圖4d）。

通過構建表達TCRαβ1和TCRαβ2細胞系，發現TCRαβ1細胞對MHC-1肽庫有反應，而TCRαβ2細胞無反應（圖4e）。然后將TCRαβ2作為對照，發現只有一個肽段激活了TCRαβ1細胞，即來源于EB病毒反式激活蛋白BZLF1的7-RAKFKQLL（圖4f,g）。

以上，研究者通過對TCR的測序及分析發現了AD中一種新型的TCR，對EBV反式激活蛋白BZLF1具有特異性。

圖4 AD患者CSF細胞中TCR的抗原鑒定

綜上所述，研究者通過對TCR序列的分析證明了AD中CD8⁺ T細胞的抗原特異性克隆的擴增，并鑒定出EBV抗原的特異性TCR，雖然還不足以說明EBV感染與AD之間有明確的因果關系，但通過分析TCR，鑒定克隆以及通過TCR識別抗原的方法將會為研究神經退行性疾病的適應性免疫提供新的途徑。

原文鏈接：http://nature.webvpn.ustc.edu.cn/articles/s41586-019-1895-7

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