說(shuō)到癌癥，每個(gè)人都聞風(fēng)喪膽，對(duì)于科研工作者來(lái)說(shuō)，也是一直重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象。癌癥中l(wèi)ncRNA的研究，曝光度非常之高。近日，來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在知名期刊Nucleic Acid Resrarch在線發(fā)表了一篇有關(guān)lncRNA的文章，其中測(cè)序和生信分析工作由烈冰協(xié)助完成。

研究背景

ESCC（esophageal squamous cell carcinoma，食管鱗狀細(xì)胞癌）是發(fā)生于食管，向鱗狀上皮分化的惡性腫瘤，占食管癌的絕大多數(shù)。LncRNA CCAT1（colon cancer associated transcript 1，結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物-1）在很多種類(lèi)的癌癥中被研究過(guò)，但在食管鱗狀細(xì)胞癌中的功能一直沒(méi)有被證實(shí)。該研究主要是針對(duì)lncRNA CCAT1在ESCC中的調(diào)節(jié)機(jī)制開(kāi)展的。

研究結(jié)果

研究者發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達(dá)顯著增加，ChIP-qPCR證實(shí)H3K27乙酰化激活CCAT1的表達(dá)。進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)CCAT1的敲低顯著抑制了細(xì)胞的增殖和遷移。RNA-Seq分析證實(shí)CCAT1的敲低優(yōu)先影響的基因都和細(xì)胞的增值、遷移、粘附有關(guān)。細(xì)胞核中，CCAT1調(diào)節(jié)SPRY4（sprouty RTK signaling antagonist 4）啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白甲基化；細(xì)胞質(zhì)中，CCAT1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-7（一種靶向作用于CCAT1和HOXB13的microRNA），從而調(diào)控HOXB13（homeobox B13，HOX基因之一，可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移）促進(jìn)細(xì)胞增值和遷移。

為了準(zhǔn)確找到ESCC中與CCAT1相關(guān)的通路，烈冰協(xié)助研究者對(duì)用si-CCAT1轉(zhuǎn)染的Eca-109細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

生信分析思路

圖1. CCAT1敲低后Eca-109細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析思路

差異基因分析結(jié)果

圖2.si-NC處理的細(xì)胞和si-CCAT1處理的細(xì)胞差異基因表達(dá)的聚類(lèi)圖（差異倍數(shù)≥1.5倍），具有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)

GO分析結(jié)果

圖3.表達(dá)改變的基因的GO分析

從圖3中不難看出，最顯著富集的生物學(xué)過(guò)程主要涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附以及細(xì)胞凋亡。這些包括許多著名的和細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)的基因，如HPGD, ADAM19, CASP14, IGFBP1, FAT4, SPRY4,KLF6, BTG2, IGFBP3, GDF15, FAS, p15, p27, COX17,ATF4, JUND, HOXB13, CDC25B, CCND3, MMP14,MMP28,MAPK4，AQP8等。

結(jié)果驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確認(rèn)CCAT1的功能，研究者設(shè)計(jì)了qRT-PCR的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在兩個(gè)不同的細(xì)胞系中證實(shí)了敲低或者過(guò)表達(dá)CCAT1能夠影響上述相關(guān)基因的表達(dá)。（圖4）

圖4. 通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在CCAT1敲低（siRNA和ASO）和CCAT1過(guò)表達(dá)中mRNA的改變

很多研究證實(shí)大量lncRNA與染色質(zhì)修飾酶共同作用促進(jìn)表觀遺傳活化或基因表達(dá)沉默，為了探究CCAT1介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制，研究者又進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)用ASO敲低CCAT1后降低了SPRY4啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，CCAT1過(guò)表達(dá)可以增加甲基化水平，從而證實(shí)CCAT1能夠調(diào)控SPRY4，通過(guò)抑制SPRY4的表達(dá)，影響食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。

圖5. SPRY4的表達(dá)受CCAT1調(diào)控，且其過(guò)表達(dá)會(huì)抑制ESCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

RNA-Seq發(fā)現(xiàn)CCAT1的敲低明顯減少一系列促進(jìn)ESCC增殖和遷移的基因。HOXB13是HOX基因之一，可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移。研究者在蛋白水平證實(shí)了這些結(jié)論，qRT-PCR分析也發(fā)現(xiàn)HOXB13在ESCC組織中顯著上調(diào)。進(jìn)一步分析表明，CCAT1與HOXB13表達(dá)呈正相關(guān)（圖6A）。為了探討CCAT1調(diào)控HOXB13表達(dá)的機(jī)制，研究者又進(jìn)行了熒光素酶測(cè)定等一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們的調(diào)控機(jī)制跟miR-7有關(guān)，CCAT1的敲低使miR-7的表達(dá)增加，但CCAT1過(guò)表達(dá)使miR-7的表達(dá)減少（圖6B）。miR-7可以靶向結(jié)合CCAT1和HOXB13，CCAT1的敲低明顯降低HOXB13 3’UTR的熒光素酶強(qiáng)度，可見(jiàn)CCAT1是HOXB13豐富表達(dá)所必需的（圖6C）。

圖6. CCAT1在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-7促進(jìn)HOXB13表達(dá)，從而促進(jìn)ESCC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移

結(jié)論

該研究證實(shí)了CCAT1啟動(dòng)子的乙酰化促進(jìn)了ESCC中CCAT1的上調(diào)。與mRNA類(lèi)似，lncRNAs的轉(zhuǎn)錄受到典型的表觀遺傳學(xué)調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的調(diào)控。在體外與體內(nèi)的研究也發(fā)現(xiàn)下調(diào)CCAT1的表達(dá)可以抑制ESCC細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)， CCAT1介導(dǎo)的組蛋白甲基化（H3K9me3和H3K9me3）也可以抑制SPRY4在癌癥中的表達(dá)（SPRY4在很多癌癥中表現(xiàn)出抑癌基因的功能）。

圖7. CCAT1在ESCC內(nèi)增殖和遷移過(guò)程的模型

研究者最終證實(shí)，CCAT1可以促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和遷移。在細(xì)胞核中，CCAT1可通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)SPRY4的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)該功能；在細(xì)胞質(zhì)中，則可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-7，從而促進(jìn)ESCC的細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移。CCAT1在ESCC的腫瘤發(fā)生中可能表現(xiàn)出不同的調(diào)控機(jī)制。（圖7）

原文鏈接：www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5389582/pdf/gkw1247.pdf