腸道和腎臟本是井水不犯河水的兩個領地。但今天，我們要揭秘一場跨越腸道與腎臟的秘密行動——一場由腸道的“隱形俠”CXCR6⁺ ILC3s領銜的“遷徙大戲”。它們攜帶著PD-1的神秘力量，悄無聲息地潛入腎臟，搖身一變成為加劇纖維化的“破壞者”…

2024年5月29日，中山大學附屬第一醫院周怡教授、陳崴教授及哈佛醫學院布萊根婦女醫院Joseph V. Bonventre教授共同通訊（梁州、唐子雯、朱昌健為論文共同第一作者）合作在Immunity（IF=32.4）上發表了題為“Intestinal CXCR6+ ILC3s Migrate to the Kidney and Exacerbate Renal Fibrosis via IL-23 Receptor Signaling Enhanced by PD-1 Expression”的文章。研究團隊揭示了腎臟纖維化腸道中的CXCR6+ ILC3s從腸道到腎臟的遷移途徑，以及腎臟中表達PD-1的ILC3s通過調節IL-23受體內吞，增強IL-17A的產生，從而加劇纖維化。

烈冰生物參與了本研究的單細胞測序和生物信息數據分析工作。

下面，讓我們跟隨這篇文獻，探索腸道與腎臟之間的隱秘聯系以及腎臟纖維化治療的新思路！

研 究 背 景

      在人體的浩瀚免疫系統中，有一群神秘的戰士——先天淋巴細胞（ILCs），它們是免疫反應的先鋒，快速響應外界威脅，保護我們的健康。ILCs家族中，ILC3s尤為特殊，它們不僅在維護粘膜屏障的穩態中扮演著重要角色，還與組織修復、抗細菌感染以及腫瘤免疫監視等生理和病理過程密切相關。最新研究發現，ILC3s在肝臟纖維化中也扮演著關鍵角色。但是，ILC3s是否參與腎纖維化尚不清楚，而腎臟纖維化是幾乎所有慢性腎病（CKD）的共同結局，研究ILC3s在腎臟纖維化中的作用對于腎臟疾病的治療十分必要。

單細胞實驗設計

單細胞實驗分組：

不同疾病階段：

1）UUO處理0d 小腸（steady state (pre-migration)）

2）UUO處理3d 小腸（mobilization state (post-migration)；

UUO處理3d 腎臟（early fibrosis）

3）UUO處理14d 腎臟（late fibrosis）

處理：分選小腸和腎臟中的ILCs細胞

單細胞捕獲平臺：BD Rhaphsody

主要技術手段：單細胞RNA測序（scRNA-seq）、基因工程小鼠模型、ELISA、免疫熒光染色、流式細胞術等
烈冰Novelbrain云平臺分析工具：細胞聚類分析、SubCluster分析、擬時序分析、基因差異表達分析等、KEGG分析等

主要研究結果解析

01 IL3s在腎臟纖維化中的積累

      研究團隊發現在CKD患者和小鼠模型中，腎臟纖維化的程度與腎臟和血液中ILC3s的增加有關。研究者首先通過免疫熒光染色分析了CKD患者腎臟活檢樣本中的ILC3s，發現它們主要位于纖維化區域，并且與α-SMA（纖維化指標）表達呈正相關。接著通過流式細胞分析，證實了在CKD患者中，腎臟和外周血中ILC3s的比例顯著升高。

      為了進一步表征ILC3s，研究團隊建立了兩種經典的腎纖維化小鼠模型：UUO（單側輸尿管梗阻）和FA（葉酸）誘導，發現腸道ILC3s能夠迅速遷移到受損的腎臟。通過免疫熒光和流式細胞術的分析，研究者發現這些ILC3s在腎臟中的積累與腸道中ILC3s的減少相對應，表明了腸道到腎臟的遷移。

02 單細胞測序助力揭示ILC3s遷移的機制

      研究團隊通過scRNA-seq分析了來自不同疾病階段UUO小鼠的腎臟和腸道ILCs。為了保證后續分析的可靠性，研究者與烈冰的生信團隊對數據進行嚴格的質控，最終獲得了8,294個腎ILC3s細胞和7,288個腸ILC3s細胞。研究者使用UMAP聚類分析區分不同的ILCs細胞亞群，接著對ILC3s進行擬時序分析，結果表明，腸道細胞主要停留在運動軌跡的初始階段，表明它們可能來源于腸道并遷移到腎臟。然后分成兩個不同的分支—一個向腎ILC3s發展，另一個維持腸道基因表達，表明它們可能來源于腸道并遷移到腎臟。研究者進一步分析了腎臟和腸道ILC3s中趨化因子受體的基因表達，發現都高表達CXCR6和CXCR4，暗示這些受體在ILC3s遷移中起關鍵作用。

此外研究者觀察到腎臟纖維化小鼠模型和CKD患者中，受損腎小管的CXCL16組織表達和血清中可溶性CXCL16 (sCXCL16) 水平均升高，表明腸道CXCR6+ILC3s的遷移可能是由腎臟表達和釋放CXCL16而進入循環所驅動的。進一步的，研究者通過藥理阻斷實驗、CXCR6缺陷小鼠模型、Kaede轉基因小鼠模型等實驗證明了腸道ILC3s通過CXCR6-CXCL16信號傳導遷移到受損腎臟，并可能在腎臟纖維化過程中發揮作用。

03 ILc3s促進腎臟纖維化

研究團隊使用Rorc-/-小鼠模型（缺乏RORγt，這是ILC3s和Th17細胞所必需的），通過骨髓移植實驗，研究者發現在缺乏ILC3s的情況下，腎臟纖維化程度減輕。在所有模型中，腎臟中ILC3s的空間組織和數量與纖維化微環境的大小正相關。接著，將分離的腸道ILC3s通過靜脈注射到Rag1-/-小鼠中，研究者發現腎臟中ILC3s的數量顯著增加，并在缺乏適應性淋巴細胞的情況下加劇了腎臟纖維化。這些結果表明ILC3s在腎臟纖維化中起著重要的促進作用，并且它們通過形成纖維化微環境直接影響腎臟成纖維細胞的活化和ECM的產生。

04 PD-1表達的調控作用

      通過單細胞測序數據，研究者發現在纖維化腎臟中，PD-1陽性的ILC3s與CXCR6的共表達顯著，表明新遷移到腎臟的CXCR6+ ILC3s表達了PD-1。使用Pdcd1-/-（PD-1基因敲除）小鼠模型，研究者發現PD-1缺失并不損害ILC3s的遷移能力。將Pdcd1-/-或WT（野生型）小鼠的純化腸道ILC3s轉移到UUO（單側輸尿管梗阻）模型的受體小鼠中。研究結果表明PD-1表達增強了ILC3s的促纖維化作用。進一步通過實驗驗證表明，PD-1陽性ILC3s在腎臟纖維化的發展中可能起到關鍵的促進作用。

05 PD-1在ILC3s中的作用

為了深入了解PD-1+ ILC3s對腎纖維化的影響機制，研究者從Pdcd1-/- UUO3d腎臟中分離了CD45+LIN-CD127+ ILCs，用于scRNA-seq。結果表明，與WT-ILC3s相比，Pdcd1-/-ILC3s中 IL-17A基因表達下降，表明PD-1缺失導致IL-17A產生減少。隨后分析證實，與腸道ILC3s相比，腎臟ILC3s能夠產生大量的IL-17A，并且PD-1陽性ILC3s的IL-17A分泌能力增強。接著，小鼠模型等功能實驗共同表明，PD-1+ ILC3s通過產生IL-17A直接促進腎臟成纖維細胞的擴張和活化。最后，通過結構預測和共免疫沉淀等實驗，研究者發現PD-1可能與IL-23R發生物理相互作用。這種相互作用可能通過競爭性結合IL-23R，抑制其內吞作用，從而維持IL-23R在細胞表面的表達。

全文總結

      本研究使用單細胞轉錄組測序技術以及大量的功能實驗驗證，提供了腸道ILC3s在腎臟纖維化中作用的新見解，即ILC3s通過CXCR6-CXCL16信號傳導從腸道遷移到腎臟，揭示了PD-1在調節ILC3s促纖維化效應中的重要作用。這些發現為預防和治療CKD提供了新的途徑。

更多詳細內容參考原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.05.004

烈冰助力腎臟相關文獻

      烈冰已助力Immunity、Theranostics、Nature Genetics等在內的多篇腎臟高分文獻發表。