既往研究發現，EGFR突變型肺腺癌（EGFR-LUAD）的PD-L1表達和腫瘤突變負荷（TMB）都較低，免疫治療療效不佳。而針對該疾病的免疫微環境（TME）尚不清楚，這都為EGFR-LUAD的治療增加了難度。

本期，小編為您帶來一篇廣東省人民醫院肺癌研究所周清教授（通訊作者）和楊蕾博士（第一作者）在Journal for ImmunoTherapy of Cancer雜志（IF=13.751）上發表的文章，題目為“Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma”。該文章從細胞成分和功能的角度來揭示EGFR突變型肺腺癌的特異性腫瘤微環境（TME），為該疾病的免疫治療策略提供了新的思路。

烈冰生物參與了本次單細胞測序實驗和數據分析工作，下面請跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結果分析吧~

樣本信息

①8名患者的9個LUAD腫瘤樣本

EGFR突變（EFGR+）：EGFR未突變（EFGR-）=5：4

其中EGFR-樣本共獲得18704個細胞，EGFR+獲得了22095個細胞。

②公共數據庫多原發性肺腺癌新輔助免疫治療后樣本（n=3）數據的聯合分析

主要分析方法

細胞聚類分析，差異基因表達分析，擬時序分析，細胞通訊分析，GO Pathway分析，多重熒光免疫組化（mIHC）等

單細胞捕獲平臺

BD Rhapsody

研究結果解析

基于NovelBrain生信分析平臺的分析，將獲得的40,799個單細胞確定為8種主要的細胞類型：上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、單核細胞、T/自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞、B/漿細胞和肥大細胞。此外，細胞注釋和占比統計發現，EGFR突變型和野生型樣本的細胞類型占比存在顯著的差異，其中T/NK細胞在兩類腫瘤中的數量和占比相似，EGFR+樣本中存在更多的單核細胞、肥大細胞和內皮細胞，而EGFR-組的中性粒細胞和成纖維細胞比例更高。

針對上皮細胞，采用sub-Cluster分析將9067個上皮細胞分為13個亞群，進一步采用inferCNV分析將其分為惡性上皮和非惡性上皮兩類，而差異基因表達分析發現，CCL18, CXCL1和CXCL3在EGFR+組的惡性上皮細胞中表達水平更高，可能參與巨噬細胞分化和招募Treg細胞；IL-7和IL-8等基因在EGFR-組的表達相對更高，說明相較于EGFR+組，EGFR-的惡性上皮可能更容易促進CD8+T細胞增殖。

此外，研究團隊為了驗證上皮細胞對于免疫治療產生的影響，下載了公共數據集中免疫治療后的單細胞測序樣本數據，針對數據的聯合分析發現，EGFR+組的上皮細胞與免疫治療無效樣本的上皮特征相似，而EGFR -組與治療有效樣本的上皮特征相似，即EGFR+肺腺癌可能對免疫治療的反應較差。進一步的上皮細胞擬時序分析表明，EGFR的突變導致了正常上皮細胞分化差異，而beam分析表明，EGFR+組的惡性上皮具有更多與代謝途徑相關的基因（如糖酵解、氨基酸代謝等）,可能抑制了CD8+ T在內的T細胞和其他免疫細胞的功能。

對T細胞的細分發現，CD8+組織駐留記憶細胞（CD8+ TRM）和CD8+增殖T細胞（CD8+cycling T）主要存在于EGFR-組中，且檢測到CXCL13基因（參與促進三級淋巴結構生成）的表達，而EGFR+組中基本沒有表達，說明EGFR+組缺乏CD8+TRM且無法分泌CXCL13促進三級淋巴結構的生成。此外，差異基因表達分析還發現多種免疫檢查點（PDCD1、TNFRSF9和ICOS等）在EGFR-組的表達，而EGFR+組中很少但高表達一些免疫抑制因子（CCL4、IL-1β等），以上分析結果也得到了mIHC的驗證，說明EGFR突變肺腺癌更難形成對免疫治療有利的免疫微環境。

此外，研究團隊發現CCL2、CCL13、GDF15和CXCL17高表達于EGFR+組中，這些細胞因子多與抑制免疫的微環境相關。相比之下，EGFR-組中的腫瘤相關巨噬細胞（TAM）可能通過表達CXCL9來招募TRM細胞增強腫瘤浸潤效果。進一步的細胞通訊分析發現，巨噬細胞是整個細胞通訊網絡的關鍵環節，其中CHIT1_TAM亞群可能在EGFR-組的腫瘤微環境中具有很強的調節能力，以直接和間接地介導TRM的激活和駐留，而在EGFR+肺腺癌中缺失相關的TAMs。相似的，EGFR+組也缺失相關CAF，無法誘導CD8+ T細胞轉化為CD8+ TRM細胞，即EGFR突變肺腺癌因缺失TAM和CAF，導致無法招募、駐留和擴展CD8+TRM細胞，進而無法形成三級淋巴結構。

最后，基于CD8+ TRM的重要性，研究團隊采用細胞通訊分析發現，CD8+ TRM與成纖維細胞和CHIT1_TAM等細胞存在相互作用，如成纖維細胞通過TGFB2-TGFBR2 和 TGFB3-TGFBR3 配受體的結合，促進了CD8+ T轉化為CD8+TRM細胞。此外，與EGFR野生型肺腺癌相比，EGFR突變型腫瘤的T細胞和其他細胞類型之間的多種免疫檢查點相關互作通訊顯著減少（如PD-1和PD-L1），而缺乏CD8+ TRM很可能是導致其形成腫瘤免疫抑制型微環境的關鍵因素。

全文總結

研究團隊利用單細胞測序聯合公共數據分析、多重熒光免疫組化驗證等方法，探索了單細胞水平上EGFR突變肺腺癌的免疫微環境景觀：多種細胞成分可能通過影響CD8+ TRM抑制了EGFR突變LUAD的特異性腫瘤微環境，即CD8+TRM的缺陷可能是EGFR突變型LUAD抑制性TME的關鍵因素。這也為EGFR突變肺腺癌的聯合免疫治療提供了新的思路。

原文鏈接：

http://dx.doi.org/10. 1136/jitc-2021-003534