俗話說：“牙痛不是病，痛起來真要命。”不注重維護(hù)口腔健康，只有等到牙痛，口臭等病癥出現(xiàn)之后才會(huì)引起人們的警覺，例如齦炎未能及時(shí)治療，炎癥可由牙齦向深層擴(kuò)散至牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)而發(fā)展成牙周炎。牙周炎是牙周組織的慢性炎癥，會(huì)導(dǎo)致牙槽骨破壞和失牙，我國(guó)成年人發(fā)病率高達(dá)80%。

本期，小編為您帶來一篇南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院孫雯老師團(tuán)隊(duì)（陳玥碩士為第一作者）在Theranostics（IF=11.556）上發(fā)表的文章，題目為Single-cell RNA landscape of the osteoimmunology microenvironment in periodontitis。該文章主要利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)等，創(chuàng)新性的從細(xì)胞層面揭示了牙周炎患者牙周組織的骨免疫微環(huán)境，為探究牙周炎的發(fā)病機(jī)制及牙周炎牙槽骨的再生途徑提供了新思路。

烈冰生物參與本研究中的單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和數(shù)據(jù)分析過程。

# 樣本信息 #

樣本類型：

牙周組織（包括牙槽骨，牙齦，牙周膜三部分）

實(shí)驗(yàn)樣本：

健康對(duì)照(HCs)  n=4；

重度牙周炎患者(PDs)  n=5；

經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后一個(gè)月內(nèi)的重度牙周炎患者(PDTs)  n=3。

# 主要的單細(xì)胞分析工具 #

subCluster分析，QuSAGE分析，差異基因表達(dá)分析，擬時(shí)序分析，細(xì)胞通訊分析

# 捕獲平臺(tái) #

BD Rhapsody

# 研究結(jié)果 #

1. 牙周組織的細(xì)胞鑒定

為了探討牙周組織中細(xì)胞群的構(gòu)成，作者對(duì)4名健康對(duì)照（HCs）、5名重度牙周炎患者（PDs）、3名牙周基礎(chǔ)治療后一個(gè)月內(nèi)的重度牙周炎患者（PDTs）的牙周組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)，總共獲得51248個(gè)細(xì)胞，鑒定出了10種主要細(xì)胞群體，分別是T細(xì)胞，B細(xì)胞，漿細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肥大細(xì)胞，上皮細(xì)胞，髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)。進(jìn)一步，作者比較了不同細(xì)胞群體的占比情況，在疾病組（PD組）中，T細(xì)胞與健康組（HC組）相比明顯減少，治療后（PDT組）有所恢復(fù)；PD組中的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞較HC組顯著增加；PD組中成纖維細(xì)胞的占比在三組中最高。

2. 成纖維細(xì)胞（Fibroblast）的亞型鑒定

大量的研究表明，成纖維細(xì)胞在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)，協(xié)調(diào)炎性反應(yīng)，介導(dǎo)組織損傷等方面有重要作用。基于本研究，作者發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)治療后，牙周炎患者的牙周組織中成纖維細(xì)胞顯著下降，對(duì)其細(xì)分后鑒定出了4種細(xì)胞亞型：成纖維細(xì)胞，周細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞和增殖細(xì)胞，而細(xì)分后的成纖維細(xì)胞又可分為兩大類群，分別是具有功能異質(zhì)性成纖維細(xì)胞和成骨譜系細(xì)胞（CD55⁺ 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），APOE⁺ 成骨前體細(xì)胞，IBSP⁺ 成骨細(xì)胞）。值得注意的是，成骨譜系細(xì)胞包括MSCs、成骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞均在牙周炎治療后（PDT組）顯著下調(diào)，提示這可能是牙周炎治療后牙槽骨再生困難的原因。

3. 成骨譜系細(xì)胞分化分析

隨后，作者利用流式細(xì)胞分選技術(shù)從牙周組織中分離出CD55⁺NT5E⁺LepR⁺ 細(xì)胞，在體外進(jìn)行三系分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD55⁺NT5E⁺LepR⁺ 細(xì)胞具有多向分化潛能；利用免疫熒光發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者中CD55⁺LepR⁺ 間充質(zhì)干細(xì)胞減少。進(jìn)一步，作者利用scVelo和擬時(shí)序分析探究了成骨細(xì)胞譜系的分化過程，預(yù)測(cè)牙周組織中MSCs向成骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向的分化。

4. 周細(xì)胞的多譜系分化潛力

基于周細(xì)胞具有自我更新、組織修復(fù)和再生的能力，可能在牙周炎治療后作為成骨譜系細(xì)胞的潛在替代細(xì)胞。因此，作者對(duì)周細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，并利用擬時(shí)序分析推測(cè)了細(xì)胞亞群的分化方向，發(fā)現(xiàn)CXCL12⁺ MSC-like周細(xì)胞是分化的起點(diǎn)，有向POSTN⁺/SPON2⁺ 周細(xì)胞和MYH11⁺/ACTA2⁺ 肌成纖維細(xì)胞分化的趨勢(shì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)POSTN⁺/SPON2⁺ 周細(xì)胞分化方向富集參與“成骨細(xì)胞分化”、“骨化”和“骨骼系統(tǒng)發(fā)育”的相關(guān)基因，提示存在成骨分化潛能。

5. 破骨細(xì)胞分化軌跡

基于單核細(xì)胞譜系對(duì)炎癥的反應(yīng)與作用，參與骨損傷的功能，作者對(duì)單核細(xì)胞系進(jìn)行subCluster分析，鑒定出2個(gè)單核細(xì)胞亞群、3個(gè)巨噬細(xì)胞群、1個(gè)破骨細(xì)胞群和1個(gè)樹突狀細(xì)胞群；為探究破骨細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化歷程，作者重建了單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞的發(fā)育軌跡，并進(jìn)一步利用GO Pathway分析，發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞形成的最后階段，不僅細(xì)胞分化和礦物質(zhì)吸收相關(guān)的通路顯著富集，與免疫反應(yīng)、抗原處理和呈遞及炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因也顯著表達(dá)，表明牙周組織中破骨細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥的功能。

6. 內(nèi)皮細(xì)胞亞群分析

鑒于患者樣本（較HC組）中存在大量的內(nèi)皮細(xì)胞，作者對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步分析，鑒定出了4種亞群細(xì)胞：靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和增殖內(nèi)皮細(xì)胞。隨后的SCENIC分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SOX17和TEAD3參與了穩(wěn)態(tài)和炎癥條件下的動(dòng)脈再生，可導(dǎo)致牙周微環(huán)境中動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的改變，引起內(nèi)皮細(xì)胞的顯著增加。

7. T細(xì)胞和B細(xì)胞異質(zhì)性

基于T細(xì)胞和B細(xì)胞在調(diào)節(jié)慢性炎癥中的重要作用，作者對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定了三種T細(xì)胞類型，分別是NKT細(xì)胞、CD4⁺ T細(xì)胞和CD8⁺ T細(xì)胞，而CD8⁺ T細(xì)胞又可以細(xì)分為7種亞型（CD8⁺ T_Effector，CD8⁺ T_EMRA等）。通過QuSAGE分析發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，PD組中CD8⁺T細(xì)胞的NOD-like受體信號(hào)通路、IL17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等顯著激活。另外與免疫檢查點(diǎn)基因（TIGIT, CD96, CD44）在CD8⁺ T細(xì)胞中顯著上調(diào)。B細(xì)胞群體也可進(jìn)一步分為3種細(xì)胞亞群，進(jìn)一步利用GO Pathway分析，發(fā)現(xiàn)較HC組，PD組中與炎性特異性反應(yīng)相關(guān)的通路，抗原加工和呈遞通路等被激活。

8. 牙周組織中的細(xì)胞通訊

為了闡明骨骼細(xì)胞譜系和免疫細(xì)胞間的細(xì)胞互作關(guān)系，作者利用了CellPhoneDB分析，發(fā)現(xiàn)有26942個(gè)配受體對(duì)在三組樣本中共同存在。而在內(nèi)皮細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞中，大多配受體關(guān)系主要存在于Ephrin-Eph信號(hào)通路上（參與機(jī)體多種生理病理的活動(dòng)，如骨的重塑、組織修復(fù)和纖維化等）。最后作者利用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)了Ephrin A1（內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)）和Eph A7（成骨前體細(xì)胞表達(dá)）的定位情況，發(fā)現(xiàn)HC組的牙槽骨表面有大量的Eph A7⁺ALP⁺成骨前體細(xì)胞，而PD樣本Eph A7⁺ALP⁺ 成骨前體細(xì)胞顯著下降，反而存在大量的Ephrin A1⁺CD31⁺內(nèi)皮細(xì)胞。

在本研究中作者利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，全面描繪了牙周炎骨免疫微環(huán)境細(xì)胞類型的精細(xì)變化，揭示單個(gè)細(xì)胞基因開啟或關(guān)閉的綜合景觀，勾勒骨骼細(xì)胞與免疫細(xì)胞間信號(hào)通訊的復(fù)雜過程，為深入解析牙周炎牙槽骨再生的細(xì)胞和分子機(jī)制提供了創(chuàng)新見解。

原文鏈接

https://thno.org/v12p1074.htm