骨折是最常見的骨創傷疾病，其愈合由成骨細胞和破骨細胞共同作用調節。已有研究表明B細胞影響了破骨細胞和成骨細胞的分化，但是由于骨折愈合過程中骨髓微環境的復雜性，B細胞在骨折愈合中的作用機制尚不清楚。

今天小編為大家帶來了一篇由第二軍醫大學附屬長海醫院紀方教授團隊在Frontiers in Endocrinology（IF=5.555）發表的題為“Single-Cell RNA Sequencing Reveals B Cells Are Important Regulators in Fracture Healing”的文章，揭示了B細胞在骨折愈合過程中發揮的重要作用，對骨折等骨疾病治療策略具有重要意義。

烈冰生物參與了本次單細胞測序實驗和數據分析工作，下面請跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結果分析吧~

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樣本信息

1例（＜5 d）骨折組織

1例（＞30d ）骨折組織

小鼠骨折組織（0、3、7、14d）

技術手段

單細胞轉錄組測序

免疫熒光、免疫印跡、TRAP染色

捕獲平臺

BD Rhapsody

研究結果

1、骨折組織的單細胞圖譜分析

研究者總共對9339個細胞進行了單細胞測序，通過細胞聚類分析和鑒定，獲得了13種細胞類群，包括6個中性粒細胞群、2個早期紅細胞群、2個T細胞群、1個B細胞群、1個漿細胞群和1個單核細胞群。另外對比新、舊骨折組織的細胞群發現，B細胞在數量上存在顯著的統計學差異（圖1）。

圖1 人新、舊骨折組織單細胞圖譜

2、骨折組織的B細胞鑒定

為了探究B細胞在骨折愈合中的作用，研究者利用subCluster分析，將B細胞定義為5個細胞亞群（圖2）：pDC細胞（表達CLEC4C），pro-B細胞（表達HLA-DRA和CD74），成熟B細胞（表達CD23和CD24）和漿細胞（包括P1和P2，表達J-chain）。經過統計分析發現（表1），相較于新骨折組織（Control組），骨折30天的組織（Case組）B細胞數量顯著減少，擬時序分析發現Case組各時期B細胞構成與對照組相似，在血腫形成階段，所有B細胞亞群均減少，提示了B細胞可能影響了骨折愈合過程。

圖2 人骨折組織B細胞分群分析

表1 新、舊骨折組織不同免疫細胞類型數量占比

3、小鼠骨折模型中B細胞的研究

進一步，研究者建立了小鼠骨折模型（圖3），分別在0、3、7、14d采集小鼠骨折組織細胞，獲得6個B細胞亞群：T2B、T1B、B1、B2、B1b1和B1b2。通過擬時序、細胞通訊、GO富集分析和免疫熒光染色發現，在骨痂形成過程中，B細胞的減少促進了成骨細胞和破骨細胞的分化，而在骨痂愈合過程中，B細胞的增加抑制了成骨細胞和破骨細胞的分化（圖4），即B細胞在骨折愈合過程中發揮了重要作用。

圖3 小鼠骨折模型

圖4 小鼠骨折模型中B細胞的作用

4、B細胞外泌體體外和體內作用

研究者進一步通過體外細胞培養實驗發現，與B細胞共培養后，破骨細胞分化增加，成骨細胞分化減少。后經過免疫印跡、RT-qPCR等實驗（圖5），證實了B細胞外泌體在體外抑制成骨細胞分化，促進破骨細胞形成。

圖5 B細胞外泌體體外實驗

最后研究者將B細胞外泌體注射到小鼠體內連續8周，發現實驗組小鼠的骨小梁體積、數量和厚度顯著低于對照組，骨小梁間距顯著高于對照組（圖6）。

圖6 B細胞外泌體體內實驗

結論

綜上所述，文章通過單細胞轉錄組測序等技術，解析了在骨折愈合不同階段，骨髓微環境中免疫細胞類型的變化，發現B細胞在骨折愈合過程中的重要作用。另外，B細胞外泌體可以調節成骨細胞和破骨細胞的分化，為B細胞外泌體研發治療骨折或骨質疏松等疾病的納米藥物提供新的思路。

原文鏈接

https://doi.org/10.3389/fendo.2021.666140