號外號外！前列腺癌Nature子刊發文后續，針對免疫療法對前列腺癌治療效果差的問題，上海長征醫院任善成教授團隊應用單細胞測序持續發力，挖掘前列腺癌免疫療法的重要靶點。

繼NCB文章發表研究進展后，2021年11月，任善成教授團隊再次于國際權威期刊Clinical Cancer Research（IF=12.53）上，發表前列腺癌免疫治療的前沿研究性論文——“Single-cell analysis reveals EP4 as a target for restoring T cell infiltration and sensitizing prostate cancer to immunotherapy”。這篇文章主要內容是利用單細胞測序等技術揭示了EP4（PTGER4）作為恢復T細胞浸潤和使前列腺癌敏感的靶標。

烈冰生物有幸參與本研究中的單細胞測序和數據分析工作，下面我們一起了解一下本論文的研究思路和數據分析過程吧~

樣本信息

樣本收集：

13個原發前列腺癌PCa樣本（10X Genomics平臺）

4個去勢性前列腺癌CPRC樣本（BD Rhapsody平臺）

單細胞捕獲平臺：10X Genomics、BD Rhapsody

技術手段

單細胞轉錄組測序

流式細胞分選

細胞培養技術

普通轉錄組測序

藥物治療模型

細胞趨化因子分析技術

單細胞分析工具應用

標準化主成分分析

細胞類型鑒定

subCluster分析

差異基因表達分析

擬時序分析

接下來，小編將從以下6個方面為大家詳細介紹一下這篇文章中的主要研究成果。

結果分析

1.EP4(PTGER4)作為耗竭型T細胞的marker gene

為了研究EP4在T細胞介導的前列腺癌（PCa）免疫中的作用，作者對13個原發PCa患者和4個CRPC患者的癌組織樣本進行單細胞測序研究。通過無監督聚類分析，分別利用UMAP進行可視化展示，結果如下圖1.1A。

圖1.1 原發PCa和CRPC的細胞類型鑒定

對CD8⁺ T細胞進行擬時序分析發現，原發PCa患者的CD8⁺ T細胞有兩個分化方向，基于擬時序的BEAM（Branch Expression Analysis modeling）分析，發現T細胞向耗竭轉化過程中，EP4基因表達顯著上升。同樣在CRPC患者中，也觀察到了這個現象。研究者隨后在泛癌（pan-cancer）表達譜數據水平上進一步驗證，發現在非小細胞肺癌、肝細胞癌、結腸癌中的耗竭型T細胞中也同時高表達EP4，即EP4可能是耗竭型T細胞的marker gene。進一步，作者利用Changhai，TCGA等數據庫的前列腺癌轉錄組測序數據進行分析，確定了EP4是前列腺癌耗竭型T細胞的基因標記。

圖1.2 EP4作為耗竭型T細胞的marker gene的特征

2.EP4的高表達表明免疫抑制微環境的存在

為進一步探究EP4在前列腺腫瘤免疫微環境（TME）中的作用，研究者對TAMs（腫瘤相關的巨噬細胞）和中性粒細胞的數據進行了擬時序分析和差異基因表達分析，發現原發性PCa的TAMs有兩個M2的抑制免疫的分化方向(圖2A，B)。在CRPC樣本中，鑒于BD Rhapsody平臺可以無偏的對中性粒細胞進行功能分析，采用該平臺鑒定出6個中性粒細胞亞群和2個多態核髓系來源的抑制細胞亞群（PMN-MDSCs， marker為LOX-1）。進一步，使用流式細胞術分選出LOX-1陽性的細胞，并與T細胞共培養，發現PMN-MDSCs抑制了T細胞增殖并降低了細胞毒性。擬時序BEAM分析發現，EP4表達量不同可影響PMN-MDSCs的分化趨勢；GSEA分析發現，EP4的高表達可顯著改變了白細胞偏移和趨化因子介導的信號通路，表明PMN-MDSC參與免疫微環境調節，而這也通過流式細胞分析中驗證了該結論。

圖2 EP4作為免疫抑制因子在前列腺癌免疫微環境中的作用

3.EP4拮抗劑（YY001）調節TME中T細胞和MDSCs的功能和浸潤

已有研究發現PGE2可誘導EP4表達進而促進PMN-MDSCs的發育成熟，研究團隊自主開發了一種小分子藥物YY001（EP4特異性的拮抗劑），利用YY001治療并通過FASC流式細胞分選和免疫熒光分析，發現YY001能逆轉PGE2對IFN-γ的抑制作用，其效果與另一種EP4拮抗劑（E7046）相似(圖3A)。此外，YY001可促進T細胞的增殖(分化為na?ve T和中央記憶T細胞)。在腫瘤細胞中，YY001治療顯著逆轉了PGE2誘導MDSC向TME的趨性。作者推測EP4拮抗劑和PD-1免疫治療聯合使用對PCa有較好的抑制作用(圖3）。

圖3 體內外實驗研究YY001的功能

4.YY001與抗PD-1抗體協同抑制PCa

基于先前研究，作者通過EP4拮抗藥物和抗PD-1抗體聯合用藥治療PCa，發現治療效果要好于單獨使用E7046（圖4A）；流式檢測顯示PD-1可抑制MDSCs的浸潤但不增加CD8⁺ T細胞的浸潤；與YY001聯合用藥后，MDSCs的浸潤程度明顯減少(圖4C和4E)、CD8⁺ T細胞的浸潤顯著增加(圖4D和4F)，對腫瘤組織中MDSCs和CD8⁺ T細胞也得出了同樣的結論(圖4G和4H)，即聯合用藥下，浸潤的CD8+ T細胞被極大地激活，導致殺傷腫瘤的TNF-γ以及IFN-α分泌增加(圖4I），削弱了MDSCs的免疫抑制功能，減少了MDSCs的浸潤(圖4J-L)。

圖4 YY001與抗PD-1抗體協同抑制PCa

5.聯合治療緩解前列腺腫瘤細胞的免疫抑制作用

為了進一步評估單獨使用YY001或結合PD-1抗體的療效，作者開發了一個15抗體PFC（多色流式細胞術）的panel，發現小鼠腫瘤樣本中可為癌細胞（CD45^-）和白細胞（CD45⁺）兩大類，與未治療組相比，用藥組白細胞數量顯著增加（圖5A），MDSCs細胞的數量減少，聯合治療后的細胞毒性T細胞（CTLs）增加的數量明顯多余單獨用藥（圖5B,C）。且用藥后出現了自然殺傷細胞群體（圖5D），表明YY001與PD-1抗體的聯合治療可引起殺傷腫瘤效應變化。此外，定量免疫熒光技術檢測發現，聯合治療后CD8⁺ T細胞數量增加（圖5E），即聯合用藥可促進腫瘤免疫微環境的形成，增強CD8⁺ T對腫瘤細胞的殺傷能力。

圖5 聯合治療緩解免疫抑制

6.聯合治療可抑制腫瘤生長

在動物模型中，研究者利用CD8拮抗劑阻斷CD8⁺ T細胞作用后，發現YY001單獨用藥或聯合PD-1抗體治療均抑制了腫瘤的發展（圖6A-C）。另外，CD8的阻斷不影響粒細胞浸潤，但影響了CD8⁺ CTLs細胞活性（圖6D-F），這表明CD8⁺ CTLs在治療前列腺癌中的關鍵作用。

最后作者使用了3種小鼠模型（Orthotopic, Rechallenged, humanized）驗證了YY001與抗PD-1抗體聯合用藥的治療效果，發現在Orthotopic小鼠模型中，聯合用藥幾乎抑制了腫瘤的發生，模型小鼠存活率達100%；Rechallenged小鼠模型中，聯合用藥顯著抑制腫瘤生長且延長小鼠壽命；Humanized小鼠模型中，聯合用藥療效要優于單一治療，流式驗證發現YY001和抗PD-1抗體的聯合治療顯著增加了CD45⁺ T細胞的浸潤和CD8細胞數量。以上結果說明YY001聯合抗PD-1抗體對前列腺癌的治療效果顯著。

圖6 各種前列腺癌模型中聯合治療可抑制腫瘤生長并提高生存率

總結：

本研究應用單細胞測序等技術，全面探索了前列腺腫瘤組織內細胞的基因表達情況，發現EP4作為一個marker gene在前列腺腫瘤和多種免疫細胞中特異性表達。另外，研究者自主開發的新型藥物YY001可同時作用于腫瘤細胞和周圍的免疫細胞，一舉解決“識別”和“清除”兩大難題，增強免疫細胞對腫瘤的殺傷作用。YY001與抗PD-1抗體聯合用藥，可顯著增強前列腺腫瘤免疫治療的療效，為前列腺腫瘤治療提供了新的方案。

原文鏈接

https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-21-0299

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