環(huán)境問題每況愈下：人類生產(chǎn)活動(dòng)的增加、不規(guī)范處理污染物都給環(huán)境帶來了不小的負(fù)擔(dān)，這其中重金屬污染尤為嚴(yán)重。有大量的研究表明長(zhǎng)期的鎘（Cd）暴露會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，但這其中機(jī)制尚不清楚。

針對(duì)重金屬對(duì)細(xì)胞神經(jīng)毒性的研究，烈小冰客戶——復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院常秀麗副教授課題組在Food and Chemical Toxicology(IF=6.023)上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing of mouse neural stem cell differentiation reveals adverse effects of cadmium on neurogenesis”的文章，從單細(xì)胞水平上揭示鎘（Cd）對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的分化具有毒性作用。

烈冰Novelbio參與本研究中的單細(xì)胞測(cè)序工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和數(shù)據(jù)分析過程。

一、樣本信息

樣本處理：原代的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（mNSCs）從C57BL/6小鼠中獲得，而后利用細(xì)胞培養(yǎng)（Cd處理或未處理）獲得P2代mNSCs細(xì)胞。

樣本分組：CdCl₂（+）：CdCl₂（-）= 1:1。

單細(xì)胞捕獲平臺(tái)：BD Rhapsody 平臺(tái)

捕獲的細(xì)胞數(shù)：CdCl₂(+)組4826個(gè)細(xì)胞，CdCl₂(-)組4825個(gè)細(xì)胞

二、技術(shù)手段

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞活力檢測(cè)技術(shù) 免疫熒光技術(shù)

三、單細(xì)胞分析工具應(yīng)用

細(xì)胞類型鑒定 subCluster分析 差異基因表達(dá)分析 GO/Pathway分析 細(xì)胞通訊分析

四、結(jié)果分析

1.mNSCs細(xì)胞類型鑒定

作者利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，分別獲得4826個(gè)細(xì)胞（CdCl₂(+)組）和4825個(gè)細(xì)胞（CdCl₂(-)組）并劃分為14個(gè)Cluster。利用Marker Genes判定分析，鑒定出7個(gè)主要的細(xì)胞類型，包括未成熟神經(jīng)元(Immature neuron)，星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)，神經(jīng)母細(xì)胞(Neuroblast)，浦肯野細(xì)胞（Purkinje cell），少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC），神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）和室管膜細(xì)胞(Ependymal)（圖1）。

圖1 細(xì)胞類型鑒定及主要細(xì)胞亞型鑒定

2.CdCl₂處理影響NSCs的分化

通過細(xì)胞亞型的定量分析，作者發(fā)現(xiàn)相比于未處理組，CdCl₂處理樣本中星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加了14.4%，未成熟神經(jīng)元減少了10.1%（圖2A）；而后利用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)在P2代的mNSC中，超過90%的細(xì)胞顯示了與分化相關(guān)的蛋白（SOX或NESTIN）的陽(yáng)性表達(dá)，表明P2代mNSCs具有多譜系定向分化潛能（圖2B）；進(jìn)一步，研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)用1.5(μM) CdCl2 處理后，GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）比例顯著增加，DCX（未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物）比例顯著減少，然而當(dāng)用0.75(μM) CdCl2處理后，只有DCX的比例顯著減少（圖2C,D）。表明不同濃度CdCl2處理也會(huì)影響NSCs的分化能力。

圖2 CdCl₂處理后NSCs的分化歷程

3.CdCl₂處理后的不同亞型細(xì)胞特異性反應(yīng)

接著，作者探究了CdCl2處理對(duì)細(xì)胞特異性反應(yīng)的影響，通過差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CdCl2的處理顯著影響了不同亞型細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)和差異基因的數(shù)量，進(jìn)一步，通過GO分析發(fā)現(xiàn)，雖然Cd處理使得未成熟神經(jīng)元減少，但與其相關(guān)的功能條目顯著上升（參與細(xì)胞鋅離子穩(wěn)態(tài)和銅離子解毒的基因表達(dá)上調(diào)），而與星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的GO條目卻顯著減少；Pathway分析發(fā)現(xiàn)，在多種細(xì)胞亞型中，大量的差異表達(dá)基因在核糖體通路中顯著富集，而ERK/MAPK信號(hào)通路并不豐富（圖3）。

圖3 CdCl₂處理對(duì)不同亞型細(xì)胞特異性反應(yīng)

4.CdCl₂處理對(duì)細(xì)胞通訊的影響

細(xì)胞通訊方面，作者利用CellPhoneDB分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用CdCl2處理后，不同亞型細(xì)胞間的通訊減少（圖4A)；進(jìn)一步利用韋恩分析，發(fā)現(xiàn)了505對(duì)配受體關(guān)系只在對(duì)照組樣本中表達(dá)，而CdCl₂處理樣本中僅存在49對(duì)配受體關(guān)系。另外，與未成熟神經(jīng)元數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，67對(duì)配受體關(guān)系在兩組樣本中均有表達(dá)，而30個(gè)配受體關(guān)系對(duì)僅在對(duì)照組中表達(dá)（圖4B）。其中與未成熟神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)的BAF6表達(dá)下調(diào)，而BAF7表達(dá)上調(diào)（圖4C)。

圖4 CdCl₂處理在不同細(xì)胞亞型間的細(xì)胞通訊分析

總結(jié)：

本研究主要利用了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄組層面揭示重金屬鎘對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響：CdCl₂可誘導(dǎo)減少未成熟神經(jīng)元分化、增加星形膠質(zhì)細(xì)胞分化并降低mNSC細(xì)胞間的通訊作用，這些發(fā)現(xiàn)極大地加深了我們對(duì)Cd神經(jīng)毒性的理解，并為評(píng)估環(huán)境污染物對(duì)神經(jīng)發(fā)育的毒性提供了一種新方法。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111936

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