多原發(fā)肺癌(Multiple primary lung cancer, MPLC)是一種具有獨特診斷和治療策略的肺癌亞型，雖然新輔助免疫治療在早期非小細胞肺癌中顯示可顯著提高患者生存率，但仍然只有一小部分晚期疾病患者對免疫治療有反應(yīng)；此外，由于目前尚無報道試驗評估新輔助免疫治療MPLC的可行性，這種方法是否能使多原發(fā)性病變患者受益仍不清楚。

2021年3月，廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所團隊在《Journal For Immunotherapy Of Cancer》（IF=10.252）發(fā)表了一篇題為“Multiomics analysis reveals a distinct response mechanism in multiple primary lung adenocarcinoma after neoadjuvant immunotherapy”的研究成果，該研究對1例進行了3個周期派姆單抗治療（pembrolizumab）的早期MPLC患者進行多組學分析，發(fā)現(xiàn)患者不同結(jié)節(jié)間表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的基因組表型和免疫原性差異，還揭示了Trm浸潤增加可能是PD-1阻斷后早期免疫反應(yīng)的一個獨特標記，這些都對MPLC的診斷治療方案和預(yù)后標志物的發(fā)現(xiàn)開拓了思路。

烈冰生物參與了本研究的單細胞測序和生物信息數(shù)據(jù)分析工作。

01 樣本信息

02 技術(shù)手段

多色熒光免疫組化（mIHC）

全外顯子測序

T細胞受體庫（TCR）測序

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

03 結(jié)果解析

1、 結(jié)節(jié)間基因組異質(zhì)性及T細胞受體多樣性分析

研究者首先對三個切除的結(jié)節(jié)進行了全外顯子測序和TCR測序，識別出不同結(jié)節(jié)間高度異質(zhì)性的基因組特征。對免疫治療無反應(yīng)的W1/W3均存在EGFR 21號外顯子 L858R突變，而W2在KRAS中存在致癌驅(qū)動突變。此外，HLA表型預(yù)測也表現(xiàn)出結(jié)節(jié)間高度異質(zhì)，W2中存在特異性T細胞增殖，克隆性更高但TCR多樣性更低。

2、 腫瘤細胞間差異性分析

然后，研究者利用單細胞RNA測序(scRNA-seq)的inferCNV篩選出腫瘤細胞，通過差異基因分析、基因集富集分析（GSEA）、GO分析，表征出W2和W1/W3癌細胞中差異表達的基因。發(fā)現(xiàn)W2腫瘤中HLA相關(guān)基因、補體激活及免疫相關(guān)基因均顯著上調(diào)，并參與了T細胞介導的細胞毒性和其他T細胞激活過程的正向調(diào)節(jié)。而W1/W3癌細胞中則是與細胞生長和粘附相關(guān)的基因表達上調(diào)，且生長因子信號受體轉(zhuǎn)導和細胞增殖的GO條目更為顯著，這些也在一定程度上解釋了免疫治療的有限反應(yīng)應(yīng)答。

3、 免疫微環(huán)境差異性分析

由于PD-1檢查點抑制劑針對T淋巴細胞進行治療的機制，且三個結(jié)節(jié)CD20（B細胞marker）染色均顯示已形成三級淋巴結(jié)構(gòu)，于是，研究者再次評估了有反應(yīng)和無反應(yīng)結(jié)節(jié)間免疫細胞的差異。研究發(fā)現(xiàn)，Trm亞群在W2樣本中顯著富集，且特異性高表達免疫檢查點基因，如LAG3、PDCD1、CTLA4、TIGIT和HLA-A。為了解析免疫治療對CD8+T淋巴細胞的演化影響，研究者進行了擬時序分析，發(fā)現(xiàn) W2細胞傾向于fate 2，與T細胞衰竭和細胞毒性信號相關(guān)（高表達HAVCR2、TIGIT、PDCD1、GNLY、HLA-A和GZMB）。W1/W3細胞傾向于fate 1，表現(xiàn)為GZMH、HLA-DRA和IFNG的高表達。最后，研究者利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表數(shù)據(jù)集，評估了Trm特征的預(yù)測和預(yù)后價值，發(fā)現(xiàn)高Trm浸潤的患者總生存期更長，揭示Trm在多種癌癥類型中既是免疫浸潤的預(yù)測因子，也是預(yù)后因子。

總之，該研究提示不同病變之間的基因組和免疫微環(huán)境存在差異可能會影響腫瘤治療效果，還揭示Trm浸潤增加可能是免疫治療的早期反應(yīng)信號和預(yù)后的獨特標志，這些都對未來免疫治療的生物標志物研究具有重要的意義。

針對治療前后、治療效果存在差異的樣本進行單細胞測序，有助于我們挖掘藥物治療與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系，為腫瘤的精準治療以及藥物的開發(fā)提供強有力依據(jù)。

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