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產品簡介

單細胞測序技術（Single Cell Sequencing）是在單個細胞水平上，揭示全基因組范圍內的所有基因表達情況，包括鑒定組織細胞類型，反映不同樣本間的細胞異質性和組織微環境。

【烈冰智造】于2021年9月發布了第一款用于單細胞測序的實驗耗材——PanoCell®雙通道微孔芯片；2022年9月推出了靈活度更高、兼容性更好的PanoCell®微孔芯片V2.0版。升級后的V2.0芯片將提供自研蜂巢板+BD平臺原裝進口單細胞分選試劑+華大T7超高通量測序儀的服務新方案！


我們的優勢

1. 自主研發PanoCell微孔芯片，搭配BD Rhapsody單細胞平臺+BD磁珠+BD全套原裝試劑及protocol；



2. 具有豐富的、針對不同樣本類型的單細胞懸液制備經驗，如：外周血、細胞系、新鮮/凍存器官組織、腫瘤組織，確保細胞活性達到測序要求；

3. 擁有成熟的單細胞測序文庫構建技術，一次性完成1000-10000個細胞的文庫構建，真正測全組織中所有細胞類型，做到對樣本中所有類型細胞的全面解析；





4.完善的質控流程和數據分析經驗：烈冰自研的CytoNavigator 百萬級通量數據分析系統確保數據的可靠性和質量，同時能夠提供個性化、定制化的數據分析服務，幫助研究人員從海量的單細胞數據中獲取有意義的信息。


樣本要求

樣本類型：


組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液

注：若客戶樣本為組織，且無能力進行組織解離來獲取單細胞懸液，烈冰將盡可能提供技術及實驗上的幫助，但因不同類型樣本的特異性，無法保證實驗方法適用于所有類型組織。

質量要求：

1. 細胞活性大于70%

2. 濃度為500-2000細胞/μl

3. 體積不小于200μl

4. 細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+

5. 細胞體積小于40μm

實驗流程

1. 單細胞懸液制備：根據樣本特性選擇合適的單細胞懸液制備方法，注意紅細胞裂解；如若客戶樣本為已經制備好單細胞懸液，該步驟可以省略；

2. 細胞活性檢測：細胞活性需大于70%；

3. 單細胞捕獲：通過分選平臺（BD）對每個細胞進行捕獲；

4. 細胞/轉錄本標簽添加：對結合磁珠標簽的RNA進行逆轉錄引入CB和UMI；

5. 文庫構建：對cDNA進行隨機引物PCR擴增；

6. 上機測序：烈冰推薦Illumina Hiseq或NovaSeq測序平臺，數據量100G/樣本。

數據分析流程



結果示例

1、單細胞懸液制備（附加收費項目）
根據研究目的和對象獲取新鮮的樣本，包括不同類型的腫瘤樣本及其對應的正常樣本。再根據組織樣本的特性，選擇合適的消化條件（酶液、消化溫度和時間），過篩后獲得所需單細胞懸液。

單細胞懸液的制備流程

2、單細胞計數和活性檢測
將細胞從培養液體系更換為上樣緩沖液體系（Sample Buffer），采用Countstar或BD Rhapsody Scanner能夠準確判斷細胞數量以及活性狀態。（注意：當紅細胞/死細胞比例過多時，建議去除此類細胞，保證有效數據量。）

注：活細胞檢測明場圖（左），綠色熒光（中），紅色熒光（右）

3、單細胞捕獲
采用BD Rhapsody單細胞捕獲平臺，將每個細胞及其mRNA標記上對應的標簽。將收集的帶上磁珠標簽的RNA進行反轉錄，產物可于4℃環境下帶回公司進行后續操作。

BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學領域 40年的專業技術， 采用CytoSeq技術進行單細胞捕獲。應用烈冰PanoCell微孔芯片（包含20W+的微孔（該數量級遠大于Input細胞數量）），搭配BD平臺磁珠+全套試劑+protocol，保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題，采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率，保證Input細胞的全面使用。

4、高通量測序
PCR擴增后開始進行文庫構建，獲得每個樣本的測序文庫。接著采用DNBseq-T7超高通量測序儀對單細胞轉錄組文庫進行測序，獲得每個樣本的測序數據。

DNBSEQ-T7超高通量測序儀

5、細胞數量判斷
采用Fastp軟件對下機原始數據進行質控，對質控后測序數據中的cell barcode信息及其對應的counts數進行統計，判斷測序樣本中實際檢測到的細胞數量，獲得樣本的測序細胞數，并根據最終確認的cell barcode信息提取對應的reads。

注：橫坐標為細胞數量，縱坐標為每個細胞對應的平均counts數，根據曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數量

6、基因組比對和表達量統計
以cell barcode對應的reads為研究對象，采用STAR算法將測序數據比對到物種對應的基因組上，獲得基因組比對的bam文件。再以bam文件以及基因組注釋文件為研究對象，將比對到同一基因上的UMI進行合并，并去除其中重復的UMI序列，得到每個基因的UMI數量，統計每個細胞中檢測到的基因數以及轉錄本數量，并得到表達量矩陣表。

注：左圖為細胞中總共檢測到的基因數量，右圖為去除重復UMI后統計的基因數量

7、細胞過濾和數據標化
利用基因組比對結果以及表達量結果對測序檢測到的細胞進行過濾，去除細胞中基因檢測數少、線粒體基因占比大的細胞，統計過濾后的細胞數量并得到對應的表達量矩陣表。采用數據標準化方法（CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等），對不同樣本中細胞基因表達量進行標準化，得到標準化后的表達量矩陣表。

注：橫坐標表示每個細胞中UMI的數量，縱坐標表示線粒體基因的占比情況

8、細胞亞群分析
基于每個細胞中的基因表達量數據，采用聚類算法對細胞進行亞群分析，同時采用t-SNE分析對細胞的分群結果進行可視化展示。同時，還可以對不同樣本中各細胞亞群的占比情況進行統計分析。

Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注：左圖為前列腺腫瘤組織細胞亞群鑒定t-SNE圖展示；右圖細胞亞群分群情況

9、Marker基因鑒定
鑒定不同細胞亞群中的Marker基因，并對Marker基因的表達分布進行可視化展示


Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注： marker基因的Feature Plot圖和Violin圖



10、差異基因篩選
針對所有或者特定細胞亞群，進行細胞亞群間差異表達基因篩選，獲得細胞亞群間差異表達基因。

Zhang, et al. Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.

注：該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析Heatmap圖

11、功能分析（GO Analysis）和信號通路分析（Pathway Analysis）
分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫，以及KEGG數據庫，對Marker基因/差異基因進行功能分析和信號通路分析，從而得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注：該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的GO/Pathway條目

12、SCENIC分析
基于已知的轉錄因子靶點數據庫，以及轉錄因子和靶基因的表達矩陣，采用SCENIC算法，對于轉錄因子的調控網絡進行計算，得到在每一個細胞中表達的轉錄因子的調控基因以及調控強度。


Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注：該圖為不同cluster之間轉錄因子調控強度heatmap圖


13、QuSAGE分析
基因集表達激活度定量分析，采用方差膨脹因子（VIF）診斷共線性的方法對于諸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度進行分析，比較不同Cluster所富集的基因集的差異。


Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注：該圖為不同cluster之間信號同理調控強度熱圖


高級數據分析
1、擬時序分析
以細胞的表達量數據為研究對象，采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法，在虛擬時間軸上對細胞的變化模式進行分析，模擬重建細胞的動態變化過程，獲得細胞間的狀態轉換關系，以及不同狀態細胞間差異基因的表達情況。



Chen, et al.Nature Cell Biology,  2021 Jan;23(1):87-98.

注：細胞間狀態轉換的pesudotime軌跡圖（左）、軌跡中細胞占比餅圖 和 Heatmap圖（右）



2、細胞通訊分析
以細胞亞群的基因表達量數據為研究對象，獲得細胞中的配體及受體基因的表達信息，采用Cellphone DB算法以及數據庫，得到細胞亞群間的信號通訊關系，并計算獲得關系的顯著性和強度。

Chen, et al. Nature Communication 2020; 11:5077

注：左圖：橫坐標表示細胞類型，縱坐標表示細胞間通訊配受體關系，圓圈大小表示顯著性差異水平，圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關系越強



3、TCGA預后聯合分析
以TCGA臨床信息以及篩選到的關鍵基因為研究對象，結合TCGA臨床數據，進行預后分析，獲得該基因/基因集與臨床預后之間的關系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.

注：橫坐標表示生存期，縱坐標表示占比，不同顏色曲線代表不同分組


文獻示例


[1] CD_99 G1 neutrophils modulate osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in the pathological process of ankylosing spondylitis.Ann Rheum Dis.2023 Oct；IF=27.4


[2] Immunosuppressive CD10+ALPL+ neutrophils promote resistance to anti-PD-1therapy in HCC by mediating irreversible exhaustion of T cells. Journal of Hepatology. 2023 Aug;IF=25.7


[3] Endothelial response to type I interferon contributes to vasculopathy and fibrosis and predicts disease progression of systemic sclerosis.Arthritis & Rheumatology. 2023 Jul; IF=13.3


[4] Schwann cells regulate tumor cells and cancer-associated fibroblasts in the pancreatic ductal adenocarcinoma microenvironment. Nature Communicationsl. 2023 Jul ; IF=16.6


[5] WT1+ glomerular parietal epithelial progenitors promote renal proximal tubule regeneration after severe acute kidney injury. 2023 Feb; IF=12.4


[6] Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment. GUT. 2022 Jun; IF=24.5