在WGBS測序中，我們選用bismark（http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/bismark/）軟件對fq文件進行mapping，該軟件基于bowtie或者bowtie2，將BS-seq reads C→T G→A分別轉化。再分別mapping到BS轉化過的基因組。得到的四個alignment結果來判斷最合適的unique alignment。同時軟件還可以統計出甲基化的類型如CpG、CHG或者CHH等。

1、軟件安裝

下載地址(github):https://github.com/FelixKrueger/Bismark.git

關聯軟件：samtools，bowtie/bowtie2

安裝方法：

git clonehttps://github.com/FelixKrueger/Bismark.git

tar-zxvf bismark_v0.15.0.tar.gz

2、軟件使用方法

bismark軟件分析BSSeq數據主要分為三個步驟：構建基因組并創建bowtie2索引，4次DNAmapping，統計bam文件中的信息

※構建基因組創建索引

選擇bismark軟件中的bismark_genome_preparation工具，需要給定bowtie2的路徑以及參考基因的路徑（包含fa和fai文件），操作代碼如下：

bismark_genome_preparation--path_to_bowtie2/usr/local/bowtie2/--verbose/data/genomes/homo_sapiens/GRCh37/

※mapping

選擇bismark工具進行mapping，需要給出基因組路徑（第一步中--verbose路徑），用法如下

bismark[options]{-1-2|}

例如：bismark--bowtie2--path_to_bowtie/home/novelbio/software/bowtie2/../GRCH37/-1 filtered.1.fq.gz-2 filtered.2.fq.gz-o result/

雙端數據需要輸入-1與-2，單端數據直接輸入即可

※統計bam文件信息

選擇bismark_methylation_extractor工具進行統計，用法如下：

用法：bismark_methylation_extractor[options]

測試使用代碼./bismark_methylation_extractor SRR534203_filtered.fq.gz_bismark_bt2.bam-s--gzip--bedGraph--genome_folder../ath_tair10/

其中輸入文件為第二部生成的bam文件，-s代表單端bam文件，-p代表雙端bam文件--gzip代表對結果文件進行壓縮--bedGragh代表生成帶有甲基化率的bed文件

3、結果展示

※創建參考基因組

bismark將基因組的fa文件轉化為兩份，并分別使用bowtie2構建索引

※Mapping結果

Mapping的結果中提供了reads的Mapping率，uniqueMapping情況，以及不同種類的甲基化程度

bam文件記錄展示：SRR534203.2_SN608_VA028:5:1101:24.50:89.20_length=50 16 chr3 6025118 42 49M*0 0

CTCACATCAATAAAATCTAATTCAATCCTCACCTCATCTTCAAAATAAA

FGIIIHDEJHDJIIGGIGIHHCHHGCJHFGCIHFJIHHHHHHFFDDD=1

NM:i:8 MD:Z:9G1G1G0G3G0G23G0G4

XM:Z:.........x.h.hh...xh.......................hh....XR:Z:CT XG:Z:GA

在每條reads記錄中提供了該位點的甲基化情況，在XM:Z:記錄中，"."代表不是甲基化位點，"z/Z"代表CpG位點，其中z代表未發生甲基化位點，Z代表發生甲基化的位點，

“x/X"代表CHG位點，"h/H"代表CHH位點，“u/U"代表CN或CHN位點

在生成的mapping Report結果匯總提到的發生CpG甲基化的位點個數其實就是全部reads中出現"Z"的數量總和，其他種類甲基化的算法也是一樣，甲基化率則根據（發生甲基化數量/（發生+未發生））計算

※統計結果

結果統計信息截圖

其中.bismark.cov.gz文件記錄了每個甲基化位點的覆蓋度，包含發生甲基化的reads數，未發生甲基化的reads數以及甲基化頻率，截圖如上右

bedGraph.gz文件以bed文件的格式記錄了甲基化位點的甲基化頻率

CpG_report.txt.gz文件記錄了位點，覆蓋度以及附近的位點信息

CpG_OT/OB文件記錄了每一條reads的CpG甲基化情況，OT代表original top strand，OB代表original bottom strand，文件截圖如下：