一 引言

1.1編寫目的

進行該測試以及撰寫此報告有以下幾個目的

1.通過對測試結果的分析，得到對軟件質量的評價；

2.分析在Illumina測序平臺下，tophat能夠獲得最大junction數目以及mapping率的參數；

3.分析在ionproton測序平臺下，tophat能夠獲得最大junction數目以及mapping率的參數；

4.嘗試找到參數與測序長度的經驗性關系。

1.2背景

Tophat是一個RNA-seq數據分析工具，其核心程序是bowtie或bowtie2.可以快速的確認exon-exon剪切拼接。其上游軟件是Bowtie，下游軟件是Cufflinks。

理論上，Tophat是針對Illumina Genome Analyzer開發的，針對75bp以上長度的短序列進行了優化。該軟件是現在二代測序回帖軟件中使用最廣泛的軟件。

Illumina屬于二代測序中最經典的平臺之一。其測序長度為幾十bp。

Ionproton屬于二代測序中較新的平臺，可以認為是二點五代測序平臺，其測序長度平均在100個bp以上。目前我們公司使用的就是這個平臺的進行二代測序分析。

在目前公司的數據分析中，出現主要的問題是使用tophat進行ionproton平臺分析時，默認參數的mapping率較低，同時該參數產生的junction數也很低，不足以進行差異可變剪接分析。因此，提出此次工作內容，探索更好的參數配置，提高mapping率以及junction數目。

1.3用戶群

主要讀者：公司研發部，公司管理人員。

其他讀者：項目及銷售相關人員。

1.4 數據對象：

1.5 測試階段

軟件測試

1.6測試工具

Samtools version：0.1.18；

IGV version：2.3.18；

Awk；

1.7 參考資料

《Tophat user guide》

二 測試概要

關于Tophat參數測試從2013年9月10日開始到2013年9月17日結束，共持續7天，一共94個測試用例，平均每個參數測試15次。

2.1工作計劃進展

針對Illumina平臺：

測試參數	計劃開始時間	實際開始時間	計劃完成時間	實際完成時間	工作完成情況
Anchor-length	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Max-insertion	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Max-deletion	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Splice-mismatch	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Read-mismatch	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利
Read-gap-length	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利
Read-edit-dist	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利
Segment-length	2013年9月12日	2013年9月12日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利

針對ionproton平臺：

測試參數	計劃開始時間	實際開始時間	計劃完成時間	實際完成時間	工作完成情況
Anchor-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Max-insertion	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Max-deletion	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Splice-mismatch	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Read-mismatch	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Read-gap-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Read-edit-dist	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Segment-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利

2.2測試執行

此次測試嚴格按照項目計劃和測試計劃執行，按時完成了測試計劃規定的測試對象的測試。針對測試計劃制定規定的測試策略，依據測試計劃和測試用例，將網絡數據以及我們觀測的關鍵參數進行了完整的測試。

2.3測試用例

2.3.1功能性

測試主要實現，包括較高的mapping率以及較多的junction數目。

三 測試環境

3.1軟硬件環境

四 測試結果

4.1針對Illumina測序平臺數據

為簡化回帖工作量，從測試的數據中提取了20萬條reads數據進行單端測試。

通過測試，統計出anchor-length長度對于junction數目關系如下圖所示：

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，當anchor-length大于10以后，junction數目顯著降低，而在5到10這個范圍內沒有顯著變化。

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，當anchor-length大于10以后，mapping率降低，但是可以通過豎軸可以觀測出這個mapping率的變化并不明顯。

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，junction數目與mapping率基本成正比關系。

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，read-mismatch數字升高與junction數目基本成反比關系，隨著read-mismatch數目變長，junction數目急速降低。

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，read-mismatch數字升高與mapping率基本成正比關系，隨著read-mismatch數目變長，mapping率上升明顯。

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，read-gap數字升高與mapping率基本成正比關系，隨著read-mismatch數目變長，mapping率上升。整體上升大約1.2%。

通過測試數據可以知道對于Illumina測序平臺數據而言，segment長度升高與junction的數目關系，在二十以內時，segment長度變長，junction數目上升明顯。隨著read-mismatch數目變長，mapping率上升。整體上升大約1.2%。

3.2針對ionproton測序平臺數據

為簡化回帖工作量，從測試的數據中提取了20萬條reads數據進行單端測試。

由于有了對于Illumina平臺的工作支持，所以針對ionproton的測試工作速度提高很多。

由于我們統一了read-mismatch參數，read-gap參數，以及read-edit參數。所以這三個參數的測試圖都可以從上圖中看出信息。

通過測試數據可以知道對于ionproton測序平臺數據而言，針對同一anchor-length長度而言，長度8和長度15，16的情況下junction數目可以一致，所以認為anchor-length對junction數目影響不明顯。

通過測試數據可以知道對于ionproton測序平臺數據而言，針對同一max-deletion長度而言，長度3和長度5的情況下junction數目可以一致，所以認為max-deletion對junction數目影響不明顯。

由于我們統一了max-insertion參數，max-deletion參數。所以這兩個個參數的測試圖都可以從上圖中看出信息。

通過測試數據可以知道對于ionproton測序平臺數據而言，在segment-length小于36時，可以發現隨著segment-length長度變長，junction數目升高。而在36以后這個數字下降，但是總體比30以內長度的大。

通過測試數據可以知道對于ionproton測序平臺數據而言，在segment-length小于36時，可以發現隨著segment-length長度變長，mapping總體目升高。而在36以后這個數字有下降的情況，但是總體比30以內長度的大。

五．測試結論

通過查閱已經有的資料，我們知道Illumina測序平臺和ionproton平臺最直觀的差別在于后者的平均測序長度比前者長；在我們測試的例子中，Illumina的測序長度在50-97個bp之間，而ionproton的測序長度在50到235個bp之間。從此可以看出兩者的最合適參數應該是有差別的。通過我們的參數實驗，可以知道，對于Illumina測序平臺有如下實驗結果：

1.貼合長度越短，匹配的reads數越高，相應的mapping率也在一定范圍內會升高。可知，只需要在anchor-length在5-10以內進行討論。隨著a參數的增加（從5到10），junction下降的數據很低，幾乎維持不變。因此可以認為在5-9的范圍內可以任意取值。

2.前三個參數對于序列的discard沒有影響。

3.隨著第一項參數的增加，junction數目下降很明顯，然而mapping率卻增加的很快。推測這個原因可能是因為更多的junction序列由于容錯而變成能夠匹配了。所以為了mapping率而言，我認為用默認參數就可以。

4.第二項參數的變化對于junction數并沒有影響，對于mapping率有一些影響，但是很小。可以再0~第三項參數之間隨意選取。

5.第三項參數的變化對mapping率影響很小。但是對junction的影響很大，發現這個參數越小，junction數越高。第三個參數對于junction的影響很大，這個值越小越好，由于前兩個參數應該小于或等于這個參數，當第三個參數為0時，mapping率下降非常厲害，所以不將前三個參數設置為0，

6.當segment-length為22的時候效果最好。

對于ionproton測序平臺而言，我們可以獲得如下結論：

1.anchor-length，max-deletion，max-insertion，splice-mismatch參數的變化對于junction數目，mapping率影響不大。

2.在tophat的所有的參數中，read-mismatch，read-gap以及read-edit對于mapping率的影響很大，我們發現在這三個參數都設置為6的時候mapping率能夠提升很多，變成默認參數情況下的兩倍的mapping率。

3.我們發現segment-length參數對于junction數目變化有很大影響，其中，當segment-length為36時，相比默認參數6074junction數目而言，此時的junction數目為9368.總體而言，提升效果是顯著的。

六．最后測試的參數

對于20萬reads的實驗樣本而言，參數及結果如下：

測試平臺	read-mismatch	read-gap-length	read-edit-dist	a	m	maxinsertion	max-deletion	segment	junction_num	unmapped
Illumina	1	1	1	8	1	3	3	22	4957	42902
ionproton	6	6	6	8	0	5	5	36	9368	96725