一、CIRI簡介：

CIRI 根據circRNA 連接點處的reads來識別circRNA， 在連接點處的reads 其比對情況非常特殊；

CIRI 根據3種模型來識別circRNA， 連接點處的read 叫做junction read

A)

circRNA 由3個外顯子環化形成， 由于測序讀長的限制，junction read 只覆蓋了起始外顯子和終止外顯子的部分序列，這兩部分reads的比對位置在基因組上的位置是相反的

circRNA 由3個外顯子環化形成， 由于連接點處的一個外顯子其長度太短，junction read 除了覆蓋了起始外顯子和終止外顯子的兩部分序列外，還覆蓋了中間的一個外顯子的部分序列

C)

circRNA 由1個外顯子環化形成, junction read 除了覆蓋了整個外顯子外，還重復又讀了一部分序列

D）

為了進一步降低假陽性率，CIRI 通過以下3條規則對結果進行過濾：

1）雙端測序的兩條reads 必須符合PEM 信號，以上面的示意圖為例，進行說明read1 是一條junction read, 來源于兩個外顯子，根據read1 的比對情況，確定了circRNA 在基因組上的位置，此時，如果這個circRNA 識別準確，那么read2 就肯定落在對應的位置內；

根據兩條reads的比對情況，進一步過濾結果；

2） 檢測到的circRNA 的連接處符合AG-GT 剪切信號；

3）根據比對的質量和數量進行過濾，質量就是說mapping 的質量越高，識別的circRNA 越準確；數量就是說對于某個circRNA來說，檢測到的juntion reads 越多，說明這個circRNA越可靠；

上面圖中的幾種模型只是幫助我們理解了exonic-circRNA的檢測，其實對于non-exonic circRNA（包括intronic  circRNA 和 intergenic circRNA)的檢測，其原理是相似的，只是綜合考慮了測序讀長和連接點兩段序列的長度，提出幾種可能的比對模型，然后根據比對模型來檢測對應的junction reads, 從而預測circRNA;

circRNA 結果的驗證：

以一個預測得到的circRNA chr2: 58,311,224|58,316,858 為例，在基因組上的長度為 5634bp, 其連接點為VRK2基因的exon6和exon10

理論上產生的circRNA的序列為所有外顯子組成的序列，splicing length為407bp

為了驗證該circRNA , 根據連接點兩端的序列設計引物，擴增出該circRNA 片段，跑電泳，確定產物長度

圖中的黑色片段為擴增產物的條帶，根據PAGE 電泳的結果，確定其長度；然后進行一代測序，確定具體序列

文獻：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-014-0571-3#Sec18

二、CIRI安裝

2.1 下載地址：

https://sourceforge.net/projects/ciri/files/latest/download

2.2 安裝方法：

解壓即可。

三、CIRI使用方法

Usage: perl CIRI.pl -I in.sam -O output.ciri -F ref.fa (-R ref_dir/)

Arguments:

-I, --in

input SAM file name (required; generated by BWA-MEM)

-O, --out

output circRNA list name (required)

-F, --ref_file

FASTA file of all reference sequences. Please make sure this file is

the same one provided to BWA-MEM. Either this argument or

-R/--ref-dir is required.

-R, --ref_dir

directory of reference sequence(s). Please make sure fasta files in

this directory are from the FASTA file(s) provided to BWA-MEM. Either

this argument or -F/--ref-file is required.

-A, --anno

input GTF/GFF3 formatted annotation file name (optional)

-G, --log

output log file name (optional)

-H, --help

show this help information

-S, --max_span

max spanning distance of circRNAs (default: 200000)

-high, --high_strigency

use high strigency: only output circRNAs supported by more than 2

distinct PCC signals (default)

-low, --low_strigency

use low strigency: only output circRNAs supported by more than 2

junction reads

-0, --no_strigency

output all circRNAs regardless junction read or PCC signal counts

-U, --mapq_uni

set threshold for mappqing quality of each segment of junction reads

(default: 10; should be within [0,30])

-E, --rel_exp

set threshold for relative expression calculated based on counts of

junction reads and non-junction reads (optional: e.g. 0.1)

-M, --chrM

tell CIRI2 the ID of mitochondrion in reference file(s) (default:

chrM)

-T, --thread_num

set number of threads for parallel running (default: 1)

-Q, --quiet

keep quiet when running

-D, --output_all

keep the temporary files after running (more disk space would be

needed)

四、檢測流程

1.使用BWA-MEM進行比對，

2.使用CIRI2進行檢測，使用命令如：perl CIRI2.pl -I sample.sam -O test.ciri -F chr1.fa -D -Q -0 -S 200000 -A

CIRI 運行過程中所需要的內存資源比較多