Single Cell Sequencing技術，即利用優化后的高通量測序技術（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一個單個細胞的序列信息，從而更高分辨率地揭示細胞間的細胞差異以及其在微環境中的功能情況。
那么問題就來了：
1. 如何獲得單個細胞？如果無法獲得單個細胞這一切都是不成立的。
2. 如何獲得大批量 的單個細胞？單組織細胞群體在10E6以上，如果被檢測的測序細胞數量過小精確度不足。
3. 如何低成本地獲得大批量單個細胞？單細胞測序成本非常高，尤其是需要測2000~3000個以上的細胞的時候，如果單個細胞的分選成本也很高，技術根本無法普及。
      所以，正因為這些問題的存在使得高通量測序在單個細胞測序應用中的普及度一直不足，直到幾個革命性技術的誕生。

      從上圖中我們可以看到，2010年-2014年之間，單細胞測序領域采用的主流技術的細胞通量都在100以內，哪怕是最為先進的Fluidigm C1平臺也是如此。因此我們在2014-2016年間看到的大量Single-Cell Seq的高分文章的單個細胞測序數量一般都在1000以內，因為這1000個細胞代價極大。
      Fluidigm C1平臺，是最早被應用于Single Cell領域的商業化分選技術，基于富魯達（Fluidigm®）的微流控技術，大約在幾個小時中可以捕獲96個左右的細胞，進行各類的Single-Cell測序建庫。當然，通量還是比較小。但不可否認的是，現在很多非RNA類Single Cell測序，仍然在采用這樣的技術，如Single Cell DNA-Seq，Single Cell ATAC-Seq等，都是采用此技術進行單細胞分選后再分別用不同試劑盒建庫。所以可以說，至少在10X和BD，或者其他企業推出有效的Single DNA測序技術之前，C1仍然會是市場上的重要組成部分。

引用自：http://cn.fluidigm.com/products/c1-system

      令人亢奮的是，在2014-2015年間幾個革命性技術誕生了，仿佛寒武紀大爆發一般，MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop技術在這兩年中扎堆出現，真正引爆了Single-Cell這個領域。而在2017-2018年，商業化的測序平臺（10X Genomics®, BD Rhapsody®），逐漸浮出水面，才最終讓Single-Cell測序技術走進了民用市場。

10X Genomics

BD Rhapsody

      從成本上來說，基于C1類的捕獲技術的代價非常大，單細胞捕獲成本在9-30美元不等，而且這還是一個沒有關稅、沒有代理商加價的價格。2000-3000細胞需要18000-100000美元不等的捕獲費用，可以說非壕不可用的技術。因此烈小冰暫時就不做詳細講解了。

Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods[J]. Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643. e4.

      烈小冰主要講講兩個現在的主流技術，BD Rhapsody以及10X Genomics。從誕生年代來看，兩者不分伯仲，10X Genomics起源自Drop-Seq技術，得益于哈佛大學的研究所的工作。

從Drop-Seq技術到10X Genomics技術

      BD的Rhapsody平臺，最早可以追溯到2015年Single Cell Cytoseq技術，可以說是完全同時代的技術。2017年BD也攜一篇研究腦神經的Nature Article將該商業化技術發布了。（Birey F, Andersen J, Makinson C D, et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids[J]. Nature, 2017, 545(7652): 54.）

       10X Genomics和Drop-Seq具有類似的技術原理。從橫向孔道中逐一輸入凝膠微珠，第一縱向孔道輸入細胞，凝膠微珠與細胞碰撞后會吸附在凝膠微珠上，并通過微流控技術，將之輸入到第二縱向孔道，即油相孔道中。這時候，就形成了一個個油滴，最終輸出并收集在EP管中。每一個油滴中會落入一個細胞以及一個凝膠微珠，那么在每一個凝膠微珠中上長滿了不同的Cell Barcode和UMI Barcode連接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，構成我們的捕獲凝膠微珠。而這個凝膠微珠抓手就會使用oligo dT抓住mRNA構建文庫。

10X Genomics凝膠微珠設計

      所以一個油滴=一個單細胞=一個凝膠微珠=一個RNA-Seq，可以說這就是10X的基本技術原理。
      然而市場并不只有一家Single Cell的商業化捕獲平臺，另外還有BD這個老牌的抗體巨頭的Rhapsody平臺。這個平臺又是依托什么技術，和10X Genomics技術存在什么區別呢？
      BD的技術不再采用利用微流控孔道射出細胞和射出的磁珠碰撞的過程，進行單細胞捕獲的技術，轉而采用CytoSeq特有的蜂窩板技術。該技術用20W+的微孔（該數量級遠大于Input細胞數量），保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了10X中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題，采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率（來自兩家企業商業宣傳資料比對），保證Input細胞的全面使用。對于Input細胞的量更少的情況，可以基于10E5的細胞總量開始進行前期處理以及后期捕獲操作。（烈小冰在之前的實驗技術分享里提到過 Single Cell前處理會丟失一些細胞哦！） 而在細胞捕獲完成后，進行細胞裂解后，同樣的也進行細胞中RNA polyA序列的抓取工作。

BD Rhapsody 單細胞mRNA抓取過程

      所以一個微孔=一個單細胞=一個磁珠=一個RNA-Seq，可以說這就是BD的基本技術原理。
      從現有數據來看，我們很難比較兩種技術的優劣，但是從現有的文章發表情況來看，兩種技術都在主流高IF期刊上有可信的數據發表，并且都與Smart-Seq數據的結果存在比較，因此兩種技術都是可用可信的大規模Single Cell RNA-Seq技術。從發布時間來看，10X發布更早，而BD發布在其1年之后，這點上10X Genomics的設備稍占優勢。而在捕獲效率和有效性來看，BD Rhapsody的捕獲效率更高較占優勢。
      從技術原理上分析兩種Single Cell測序技術，都是基于UMI（Unique Molecular Identifier）+ CL（Cell Label）的技術，與傳統Smart-Seq + Fluidigm的C1技術比較起來，引入UMI技術（這個我們會在分析部分簡單介紹）進行表達定量，使得大規模scRNA-Seq的基因表達定量結果幾乎不會受到PCR Bias影響，從而更準確。

圖注：如果一個基因具有序列一致的UMI序列的測序Reads，那么這條Reads其實PCR Bias

相對于Smart-Seq技術在細胞數量上的問題，BD和10X這兩個平臺普遍提供的細胞數量都在1-6K不等的測序細胞量，這個量級的測序細胞量已經可以說能夠完全覆蓋絕大部分組織的Single Cell群體類型。因此，這兩種技術對于基于基因表達進行準確細胞分型上，無論是從細胞數量上來說還是表達檢測可靠性來說，都會更實用。同時依托Random Cell Label技術，使得其對于NovaSeq、HiSeq X Ten、Hiseq 4000等設備存在的Index hooping現象，相對于Smart-Seq數據來說，影響幾乎可以忽略不計（10X Genomics官方網站曾給出hooping測試結果，顯示無影響。https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/115002052846-Index-hopping-on-the-HiSeq-4000-and-its-effect-on-10x-Single-Cell-libraries）。

Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods[J]. Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643. e4.