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前幾天，小編向大家分享了單細胞TCR測序技術在阿爾茲海默氏疾病（Alzheimer disease, AD）中的研究，今天烈小冰將為大家帶來單細胞核測序技術（Single-nucleus RNA sequence, snRNA-Seq）在AD中的相關研究。
隨著單細胞轉錄組測序技術（scRNA-Seq）的蓬勃發展，其在在胚胎發育，腫瘤細胞異質性，免疫細胞轉化等多方面屢建奇功，但是由于細胞形態的不同和單細胞制備中細胞敏感性的差異等因素影響，scRNA-Seq在數據分析時可能會出現細胞類型占比失真，個別細胞類型丟失等情況。為了克服單細胞測序技術的局限性，單細胞核轉錄組測序技術（snRNA-Seq）應運而生，snRNA-Seq可利用凍存組織直接制備單細胞核進行轉錄組測序，不僅克服了細胞形態差異致使的細胞捕獲差異，還克服了單細胞測序必須使用新鮮樣本的多個局限性。
snRNA-Seq已被廣泛的用于神經科學研究，隨著鼠腦、猴腦、以及人腦細胞轉錄圖譜的不斷完善，加速推進著人類攻克神經疾病的步伐。下面就讓我們用一篇文獻走進神經疾病研究，了解單細胞核轉錄測序技術吧。
二、snRNA-Seq在阿爾茲海默氏疾病中的研究
2020年1月，nature medicine 在線發表了美國華盛頓大學醫學院Marco Colonna 和 Maxim N. Artyomov團隊的共同研究成果“Human and mouse single-nucleus transcriptomics reveal TREM2-dependent and -independent cellular responses in Alzheimer’s disease ”
阿爾茨海默病(AD)是一種具有復雜病理生物學特征的異質性疾病，大部分病例發生在65歲之后，構成遲發性癡呆（late-onset AD）。在病理水平上，AD的起因是因為β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的胞外積累，神經細胞內tau蛋白的聚集和過度磷酸化，最終導致神經突觸功能障礙和細胞的死亡。本研究利用snRNA-Seq，深入探討了小膠質（Microglia）在AD中的變化，以及小鼠和人在AD病程中膠質細胞轉錄水平的差異變化。
三、 分析思路
單細胞核轉錄組測序：
樣本信息：
鼠腦樣本：5×FAD、Trem2-/- 5×FAD、Trem2-/-、WT四種7月齡和15月齡小鼠模型皮質/海馬，每組各三只
人腦樣本：AD患病的TREM2-CV（11例）和TREM2-R62H（10例），以及正常人（11例）腦的背外側前額葉皮質
技術平臺: 10×Genomics系統，Illumina HiSeq 4000/6000
四、主要研究成果
（一）通過snRNA-Seq描述β-淀粉樣蛋白和Trem2對小膠質細胞的影響
研究者為探究小鼠對AD病程的轉錄響應，以及β-淀粉樣蛋白和小膠質在AD病程中的變化，首先對7月齡的5×FAD小鼠、Trem2敲除的5×FAD小鼠、Trem2敲除小鼠、以及野生型小鼠模型進行單細胞核轉錄組測序，總共分析了73419個細胞核。結果表明阿爾茲海默癥5×FAD小鼠的小膠質細胞數量顯著高于其他小鼠模型（圖1 e-f），同時研究者們通過對15月齡小鼠模型的分析，發現隨著時間的推移5×FAD與Trem2敲除后的5×FAD小鼠模型間小膠質細胞差異不再明顯。這說明β-淀粉樣蛋白（Aβ）對小膠質的影響部分依賴于Trem2受體。
圖1 5×FAD小鼠小膠質細胞增殖性
（二）疾病相關小膠質（DAM）轉錄變化依賴于Trem2受體
前人的研究發現，小膠質細胞不僅響應AD，同時還參與AD病程的調節。所以研究者們將小膠質細胞作為關注重點，分析了不同樣本、不同年齡段、和不同細胞類型間的差異基因（DEGs）（圖2）。發現小膠質細胞細分類群在不同樣本間有明顯差異（圖2 e-f），在5×FAD小鼠模型中，疾病相關小膠質(Disease-associated microglia, DAM)明顯增多，DAM相關的Cst7，Csf1，Apoe，Trem2，Lpl，Lilrb4a，H2-d1，Cd74和許多組織蛋白酶基因在5×FAD小鼠中也顯著上調，而小膠質細胞穩態基因P2ry12，Selplg，Tmem119和Cx3cr1則被下調（圖2 b-d）。進一步比較Trem2突變體中的小膠質細胞發現，5×FAD中DAM相關基因的表達量也較突變體小鼠高，這更加肯定了Trem2（Triggering receptor expressed on myeloid cells 2）在AD病程反應中的重要性，小膠質細胞的轉錄變化一定程度上受Trem2的影響。
圖2 5×FAD小鼠小膠質細胞的轉錄水平特性
為深入了解AD病程對大腦細胞的影響，研究者們將關注點轉移至除小膠質細胞外的其他細胞類型，同樣利用差異基因篩選的方法，研究了不同細胞類型的轉錄水平變化，發現5×FAD小鼠與WT小鼠相比，少突膠質細胞中的C4b，Serpina3a，和H2-d1基因顯著上調，且這些基因在7月齡小鼠（圖3 a）中的表達顯著高于15月齡小鼠（圖3 b）。同時通過不同樣本的比較（圖3 c）分析，說明了少突膠質細胞的轉錄變化也可能受到Aβ和Trem2的影響，繼而利用免疫熒光驗證了這一猜想（圖3 d-i）。
圖3 在AD病程中少突膠質細胞的變化
綜合單細胞核測序結果和免疫熒光結果，說明在疾病的早期階段，Aβ在小鼠體內的積累與少突膠質細胞數量、活性狀態是平行關系，可能是部分依賴Trem2。與此同時，少突膠質細胞C4b和Serpina3n的分泌，可能促進Aβ的聚集。
從snRNA-Seq數據中可以看出，相比于小膠質細胞和少突膠質細胞，Aβ的聚集對其他細胞類型轉錄水平的影響并不明顯（圖4）。
圖4 AD對其他細胞類型的轉錄水平的影響
（二）四、AD患者的腦與小鼠模型具有明顯的差異性
為更準確的反映AD病程對人腦的影響，研究者們繼續利用snRNA-Seq技術分析了TREM2-CV，TREM2-R62H，和Controls 三種人腦樣本共66311個細胞核。與正常人腦相比，AD患者的腦細胞中NEFL+ NEFM+的神經細胞（Ex1）明顯減少，這與前人研究AD病患神經元細胞丟失的結果相一致（圖5）。
同樣在人腦中進行差異基因分析發現，許多神經元基因下調，與小鼠模型相比，穩態小膠質細胞相關基因TMEM119，P2RY12，CX3CR1反而在AD患者的腦中上調表達。并且IRF8作為差異基因也在AD病患的腦中上調。這一特征不禁讓人聯想到周圍神經損傷（PNI）小鼠模型，IRF8驅動的小膠質細胞轉錄水平變化與其非常相似（圖5 c-j）。
圖5 snRNA-Seq構建AD人腦轉錄圖譜
（五）AD擾亂星形膠質與神經元的代謝協調性
比較AD患者和正常腦的基因表達變化，發現髓鞘形成相關基因（STMN4，SEMA3B，MIR219A2）在少突膠質細胞中下調表達，而CA2，SLC38A2，MID1IP1等基因卻上調表達，這樣的表達模式與AD病程致使的神經元軸突退化表型具有一致性。另一方面，5×FAD小鼠模型少突膠質細胞中上調表達的Serpina3n和C4b，在人腦中其同源基因SERPINA3和C4B卻是在星形膠質細胞中上調表達（圖6）。這一發現從側面反映出人腦和鼠腦在進化過程中的差異性。利用NanoString基因表達分析，檢測到小膠質細中IRF8基因和少突膠質細胞中的CA2基因在AD樣本中均上調表達，與snRNA-Seq結果相吻合。同時對代謝通路的分析也反映出AD病程會導致神經細胞衰退，認知能力下降的AD病理特征。
圖6 snRNA-Seq和NanoString基因表達分析解析AD人腦膠質細胞變化
（六）AD人腦中TREM2對小膠質細胞的影響
無論是前人研究還是本文小鼠模型的探究，不斷說明著小膠質細胞在AD病程中的重要性，并且本文還利用小鼠模型證明了Trem2受體在小膠質響應AD病程中的關鍵性。最后研究者們為了探討TREM2在人的AD病程是否也具有相似的作用，對TREM2-CV、TREM2-R26H和TREM2-R47H樣品進行了比較分析，發現小膠質細胞對AD的響應在三個樣品中存在差異，TREM2-R26H和TREM2-R47H的表型反應不如正常人腦，證實了小鼠模型中的結論，小膠質細胞在AD病程中的響應過程是依賴于TREM2受體的（圖7）。
圖7 R62H和R47H突變型降低了小膠質細胞對AD的響應
總的來說，本文研究者主要利用snRNA-Seq技術，先后在小鼠模型和人中證明了小膠質細胞在AD病程中的重要性，同時通過人和鼠的比較，發現了AD病程在人和鼠之間存在一定的差異性。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41591-019-0695-9（DOI: 10.1038/s41591-019-0695-9）
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