單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是成百上千個(gè)基因在上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)情況，屬于高維數(shù)據(jù)，我們需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控與過(guò)濾，將合格的數(shù)據(jù)降維到低維子空間，使數(shù)據(jù)可視化。

上一期已經(jīng)帶大家了解了scRNA-Seq數(shù)據(jù)的預(yù)處理，那么本期，小編就來(lái)介紹一下數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化與聚類(lèi)分析。

一、上海烈冰科技數(shù)據(jù)分析流程介紹

二、工具介紹

Seurat_Normalized（標(biāo)準(zhǔn)化）——采用Seurat package對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并校正批次效應(yīng)（Batch Effect），采用PCA算法及tSNE算法對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行降維處理和信息可視化展示。

Seurat_Cluster（聚類(lèi)分析）——根據(jù)基因表達(dá)的情況，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)算法（Graph-based clustering或k-means clustering) 將降維后的細(xì)胞聚類(lèi)分群。再通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析計(jì)算出不同細(xì)胞類(lèi)群的標(biāo)識(shí)基因（Marker Gene），并對(duì)所屬細(xì)胞類(lèi)群進(jìn)行推測(cè)和鑒定。

三、結(jié)果展示

（一） 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

1.線粒體RNA占比：

由于Dead Cell胞內(nèi)RNA會(huì)流出，線粒體RNA占比會(huì)隨之增高，因此我們一般通過(guò)設(shè)定線粒體RNA占比閾值來(lái)過(guò)濾Dead Cell。

左圖描述了每個(gè)細(xì)胞線粒體RNA占比—UMI數(shù)量相關(guān)性，紅色和黑色圓點(diǎn)代表兩個(gè)樣本的細(xì)胞。X軸代表每個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)的UMI數(shù)量，Y軸代表每個(gè)細(xì)胞線粒體RNA占比；右圖為細(xì)胞線粒體RNA占比分布的Violin圖。

圖中線粒體RNA占比閾值建議設(shè)為0.2，線粒體RNA占比超過(guò)0.2的細(xì)胞認(rèn)為是Dead Cell，可將其過(guò)濾掉。當(dāng)然，不同類(lèi)型的細(xì)胞線粒體RNA占比也不同，例如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等高代謝、凋亡類(lèi)細(xì)胞，其線粒體RNA占比相對(duì)較高。因此，需要結(jié)合具體的細(xì)胞類(lèi)型來(lái)最終決定線粒體RNA占比的閾值。

2.細(xì)胞的基因數(shù)量：

我們一般通過(guò)設(shè)定細(xì)胞的最小基因數(shù)量去除假細(xì)胞和低質(zhì)量細(xì)胞（Low Quality Cell）；通過(guò)設(shè)定細(xì)胞的最大基因數(shù)量可以一定程度上去除雙細(xì)胞（Doublet Cell）。

左圖為每個(gè)細(xì)胞的基因—UMI數(shù)量相關(guān)性分析圖，右圖為每個(gè)細(xì)胞基因數(shù)量分布的Violin圖。圖中基因數(shù)量閾值建議設(shè)定為200-6000，可有效去除假細(xì)胞、低質(zhì)量細(xì)胞和雙細(xì)胞。

3.PCA分析：

該圖主要描述了不同樣本中所有細(xì)胞在PC1和PC2（即主成分分析中影響最大的兩個(gè)主成分）所組成的面中的定位情況。

4.t-SNE圖：

主要展示了每個(gè)樣本中所有細(xì)胞的tSNE定位情況、樣本融合情況，以及通過(guò)基因數(shù)量、UMI數(shù)量、線粒體RNA占比進(jìn)行染色的情況，如下所示：

（二）聚類(lèi)分析

1.細(xì)胞分群的t-SNE圖：

該圖代表t-SNE定位并基于Graphcluster或者KMean算法無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)后的分群情況。

左圖中cluster8被其他群分割成兩部分，這樣的t-SNE分群結(jié)果并不是特別理想。建議調(diào)整分析時(shí)的resolution參數(shù)，將其調(diào)大，使分群更加細(xì)致。將resolution參數(shù)由0.8調(diào)至1.0，得到右圖較好的t-SNE分群結(jié)果。

2. Top20 Marker基因的Heatmap：

可觀察特定marker基因在不同cluster的表達(dá)差異，以此初步判斷細(xì)胞類(lèi)型及類(lèi)群合并。采用細(xì)線區(qū)分不同的Cluster，顏色深淺代表基因表達(dá)高低，其中黃色為高表達(dá)，暗紅色為低表達(dá)。根據(jù)各cluster的基因表達(dá)的整體類(lèi)似度，下圖可以初步判斷將cluster0、3合為一群，cluster6、7合為一群，cluster5、8、12合為一群。

3.Feature plot：

該圖主要描繪了選定Cluster中 Marker 基因在所有單細(xì)胞中的分布情況，更加直觀的了解marker基因的整體表達(dá)情況，用于判定cluster所屬的細(xì)胞類(lèi)型。根據(jù)經(jīng)典特異性marker基因的Feature plot，可以初步判斷出T細(xì)胞（CD3D）、巨噬細(xì)胞（組織樣本C1QA）、B細(xì)胞（CD79A）、成纖維細(xì)胞（DCN）、內(nèi)皮細(xì)胞（VWF、CLDN5）及上皮細(xì)胞（KRT18、EPCAM）。

4.細(xì)胞類(lèi)型鑒定結(jié)果tSNE圖：

下圖就是原始的tSNE分類(lèi)結(jié)果，共有18個(gè)類(lèi)群，此時(shí)要結(jié)合第3步中Marker基因特異性表達(dá)的結(jié)果對(duì)Cluster進(jìn)行合并。

5.細(xì)胞亞型分群圖：

該圖將0、1、2、3、4、9 Cluster合并為T細(xì)胞（CD3D）；將5、8、12 Cluster合并為巨噬細(xì)胞（組織樣本C1QA）；將11、13 Cluster合并為B細(xì)胞（CD79A）；16 Cluster為成纖維細(xì)胞（DCN）；14 Cluster為內(nèi)皮細(xì)胞（VWF、CLDN5）；將6、7、10、15、17 Cluster合并為上皮細(xì)胞（KRT18、EPCAM）。

后續(xù)可以將自己關(guān)注的細(xì)胞亞型再次細(xì)分，并進(jìn)行其功能性分析，為解讀生物學(xué)意義細(xì)節(jié)提供基礎(chǔ)，后續(xù)講解會(huì)詳細(xì)介紹。

綜上所述，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化將數(shù)據(jù)過(guò)濾后通過(guò)PCA降維，并形成t-SNE可視化結(jié)果；降維后的矩陣進(jìn)行細(xì)胞聚類(lèi)分析，并計(jì)算出各類(lèi)群的marker基因及表達(dá)量，以鑒定所屬的細(xì)胞類(lèi)型。

細(xì)胞類(lèi)型鑒定后就可以進(jìn)行后續(xù)深層次的擬時(shí)序分析（Pseudotime）、及SCENIC分析。后續(xù)小編將一一講解哦~