8012了，高通量測序早已非常普遍，走在生命科學前沿的研究者們幾乎都在談論Single-Cell Sequencing對于整個生命科學研究的意義以及價值。無論是腫瘤、發育、神經科學，還是血液免疫或者其他領域，生物學研究似乎進入了一個新的時代——單細胞時代（Single Cell Era），我們的視野越來越精準，從一塊組織轉為一塊組織中的每一個細胞。就比如，在乳腺癌中，Single-Cell Seq揭示了三陰性乳腺癌患者受到化療后，部分患者反而生存時間縮短，究其原因，是因為腫瘤異質性引起的耐藥克隆的存在。

Kim C, Gao R, Sei E, et al. Cell, 2018, 173(4): 879-893. e13.

目前在神經膠質瘤、頭頸部癌等、多種腫瘤研究中，單細胞測序都有廣泛的應用，涉及腫瘤異質性、耐藥、微環境等各方面的研究，比如下面這篇研究頭頸鱗癌的EMT效應的異質性的文章。

Puram S V, Tirosh I, Parikh A S, et al. Cell, 2017, 171(7): 1611-1624. e24.

說了這么多關于Single-Cell測序的應用情況，可能很多人還對于Single Cell是什么，它的準確定義是什么不是特別清楚，可能也會疑惑它和普通的轉錄組測序又有什么區別呢？能得到什么不一樣的結果呢？也可能會有朋友說，我連PCR產物都擴不出來的單細胞樣本，究竟是如何單個獲得的呢？這里就簡單給大家說說。

Single Cell測序技術，即利用優化后的高通量測序技術（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一個單個細胞的序列信息，從而更高分辨率地揭示細胞間的細胞差異以及其在微環境中的功能情況。

So Why Single Cell？有必要做的這么復雜么？真的有必要以一個細胞為單位進行研究么？這里就需要我們從Bulk RNA-Seq和Single Cell RNA-Seq的結果差異的角度出發說一些故事了。

眾所周知，任何一個組織實際上都是一個個細胞組成的，我們進行的所謂Bulk RNA Seq，也就是我們一直說的普通轉錄組測序就是基于這個組織塊的所有的RNA的基因表達。我們一直用這個整體的基因表達來代表這個組織塊的基因表達，然而從已有的免疫學、發育學以及神經學的研究中，都發現，在一個組織或者細胞簇中會存在不同類型的細胞，它們的基因表達以及功能也是各不相同的，這就是我們所說的細胞間異質性。就以免疫細胞為例，我們會發現里面有T細胞、B細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞、自然殺傷細胞等等，并且T細胞中還存在T-Reg、T-Na?ve、T-Active等細胞，而且這些T細胞上連接的TCR也是各不相同的，這其中存在著錯綜復雜的分類。然而這還只是血細胞中的情況，胚胎發育、大腦不同腦區神經發育等過程中的細胞轉變更是令人難以想象。可以這么說，隨著我們對于細胞的細分，很多我們曾經在教科書上見過的研究結果已經不再是金標準了。

正是在這個時代，衍生出了一種替代技術，我們稱之為微量細胞測序技術，研究者基于T細胞、B細胞等這些細胞的表面抗原，采用FACS技術或者MACS技術進行捕獲后，將細胞數量極微量的樣本的RNA，采用擴增技術擴增放大后進行測序。這個技術一定程度上解決微量細胞檢測的困難，但是仍然有非常多的問題，比如PCR會產生PCR bias，而這個問題在ctDNA檢測中也很早就被觀察到了。

為了解決PCR bias干擾基因表達的問題，unique molecular identifier （UMI）技術應運而生。主要原理是擴增前每一個轉錄本序列在添加一段獨有的隨機序列，長度為6-10個bp，以此來為一條轉錄本進行命名。一條UMI下的一條對應序列，不管如何進行PCR，，不論擴增多少次，都只計算一次。隨著這類概念的提出，可測單細胞數量在2014年-2016年之間呈現指數級增長，單細胞分選測序技術也正式進入了黃金發展階段。

隨著MARS-Seq，CytoSeq（后續發展為BD Rhapsody®技術）以及Drop-Seq（后續發展為10X Genomics®技術）的出現，人類正式可以對于一個組織或者大量細胞樣本中的細胞進行單個測定了，進入了10⁴的時代。

隨著單細胞測序技術的深入應用，它的應用從細胞類樣本，開始轉向組織類樣本，從PBMC這類早期通過FACS流式分選技術/MACS磁珠分選技術即可獲得分類的組織樣本，轉向Solid Tumor Tissue這類固態的具有大量基質細胞和混合細胞，并且存在細胞間連接的樣本，這時候，單細胞測序開始遇到數不清的困難和瓶頸。

實驗過程上來說，也是障礙重重。首先如何將組織解離為細胞個體？不同組織的條件完全不同，膠原酶I-V，木瓜蛋白酶，根據不同組織類型，處理時間完全不同。其次，如何將組織處理完畢后，保證細胞大部分存活？死細胞比率直接決定測序和分析結果的成功與否。那么又有哪些策略可以快速過濾死細胞？如何去除無意義的紅細胞？去紅細胞是否會導致基因表達變化？如何保證采樣時間一致？凍存細胞是否可以使用？否則無法做前瞻性樣本收集，只能做回顧性樣本收集了。

數據分析上來說，不同的技術不同的barcode設計完全不同，如何兼容？如何快速分析150Gb的測序數據？如何準確區分UMI定量？如何去除死細胞？如何去除雙細胞？如何去除批次效應？是否需要添加Spike-In？采用什么策略進行樣本標準化？如何準確獲得細胞數量？如何評估Hooping？問題一籮筐啊！

而更關鍵的從實驗設計上來說，到底應該如何設計樣本的分組，如何比較差異，如何找到真正具有生物學意義的問題，也是迫在眉睫的挑戰。隨著單細胞技術的持續發展，多組學、單細胞轉錄組、基因組、CNV、甲基化、表面組都會成為可能，與臨床數據間究竟該如何討論？之前的Bulk RNA Sequencing數據是從此可以進行埋葬，還是有其可以應用的方式和策略？

所以，哪怕以今天的角度來看，Single-Cell技術都還不是一個完全成熟的技術，而是一個飛速發展的技術，有別于lncRNA、circRNA這類新的研究方向的誕生，Single Cell可以說是對于現有樣本和理論的一場新的革新，從宏觀進入微觀，如同物理學以及化學一樣，必將帶來顛覆性新的結論，而我們每一個人都是這個潛在的嶄新時代的見證者和親歷者。烈冰也會陸續分享一些單細胞測序有關實驗和數據分析的關鍵技術，歡迎關注哦^^