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上一期小編推出烈冰生物關鍵技術——冷凍切片制備之后，很多老師都表示很感興趣，銷售部同事訂單直線增加。小編整理售前答疑的過程中，發現有老師們對樣本準備階段有很多疑問。那么，本期小編就來詳細介紹一下空間轉錄組（Spatial Transcriptome）樣本制備過程的具體問題，提供詳細的樣本準備指南，助力每一份珍貴的樣本都能順利進行空間轉錄組實驗。
烈冰可接受樣本類別：凍存組織，OCT包埋組織。如果樣本充足，最好準備2份及以上，一份用于RNA質控和后續的正式切片實驗；一份留作備用；如果組織樣本珍貴稀缺，可以酌情減少樣本數量。
我們請到了烈冰實驗團隊大神Dr.Han親自上手，針對小鼠的不同組織進行實驗，不斷對樣本制備操作步驟進行優化， 為老師們實際操作排雷填坑。
空間轉錄組visium捕獲芯片的限制（6.5mmX6.5mm），選擇樣本前，應先確認好最佳取材位置以及合理組織大小，保證visium芯片的有效利用率。
新鮮組織樣本取下后迅速用預冷的PBS溶液或者生理鹽水沖洗組織表面殘留，然后用干凈的吸水紙吸干液體。（此步驟一定要吸干水分，如有液體殘留，OCT包埋后，組織表面形成冰晶，影響切片效果）
整個樣本處理過程需要保持低溫環境（干冰/液氮）
先將裝異戊烷的容器放置液氮中預冷15分鐘,同時將所有過程中的采集器具進行預冷。
用預冷的樣本匙將新鮮組織浸沒在異戊烷中.速凍1min或直至組織完全冷凍。
采用異戊烷而不是液氮的原因是液氮的沸點低，組織直接放入液氮后會沸騰，在組織周圍產生氣穴，導致組織降溫過程中不同區域降溫不同，改變組織內部形態甚至碎裂，影響組織形態。因此該步驟一定要用異戊烷進行凍存，如果沒有異戊烷，可以跳過該步驟，直接將新鮮組織進行OCT包埋后速凍。
在包埋模具中加入一層OCT包埋劑，然后用預冷的鑷子迅速將組織放入；
用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。確認組織周圍沒有氣泡；立即將其放在干冰上，直至OCT完全凍結。該步驟要保證最終組織周圍無氣泡產生，氣泡的產生會在OCT冷卻后在組織周圍形成空洞，影響切片效果。
切片厚度一般設定為10μm，但是根據不同的組織類型，切片厚度也會有所調整。例如脂肪含量較高的乳腺組織可能需要更厚的切片。
切片溫度一般設定為箱體溫度：-20℃，樣本頭溫度：-10℃。不同的組織類型，樣品頭溫度會有所調整，以保證切片的光滑完整性。
切片之前需要將質檢合格的冷凍組織和玻片先放入-20℃冷凍切片機箱體中平衡30分鐘以上。
烈冰針對不同的組織類型，進行了不同切片厚度、切片溫度的嘗試與探索，優化出一系列可調整參數。整個切片過程烈冰實驗團隊會與老師保持密切溝通進行溝通，以保證獲取高質量的冷凍切片。
質控I：RIN值檢測，RIN值>7進行后續實驗，保證組織的RNA完整。
如果送樣充足，可以針對組織塊進行RNA抽提檢驗；
如果樣本珍貴，也可以在正式冷凍切片前切取一定量的切片進行RNA抽提檢測。
為了最大程度減少樣本的損失，并保證實驗的有效性，烈冰實驗團隊針對小鼠不同組織，根據組織大小、切片厚度，對20張切片的RNA總量進行統計，對正式實驗中質控所需的切片數量起到參考作用，避免造成浪費。
質控II：HE染色成像，保證冷凍切片的空間結構的完整性。前期樣本準備實驗操作失誤會嚴重影響冷凍切片的空間組織形態。
新鮮組織樣本如果表面液體沒有吸干，直接進行凍存切片會在組織周圍產生冰晶，增加組織脆性，不易切片成功，或者HE染色成像后出現條狀裂紋。
OCT包埋如果不注意處理氣泡，切片時會出現空洞現象，造成切片不連續，影響切片質量。
冷凍切片時必須保證切片無褶皺、光滑平整，組織無折疊、卷曲。
讓我們一起抓住空間轉錄組的熱潮，應在高分文章起跑線，快來聯系我們吧。烈冰生物將竭誠為您提供優質的空間轉錄組測序研究完整的解決方案！
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